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實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸:第四節(jié) 熒光顯微鏡檢查法

一、熒光顯微鏡熒光顯微鏡是免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的基本工具。它是由光源、濾板系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)等主要部件組成。是利用一定波長的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光,通過物鏡和目鏡系統(tǒng)放大以觀察標(biāo)本的熒光圖像(圖3-15)。圖3-15 熒光顯微鏡的結(jié)構(gòu)和主要部件(一)光源現(xiàn)在多采用200W的…

一、熒光顯微鏡

熒光顯微鏡是免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的基本工具。它是由光源、濾板系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)等主要部件組成。是利用一定波長的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光,通過物鏡和目鏡系統(tǒng)放大以觀察標(biāo)本的熒光圖像(圖3-15)。

圖3-15 熒光顯微鏡的結(jié)構(gòu)和主要部件

(一)光源

現(xiàn)在多采用200W的超高壓汞燈作光源,它是用石英玻璃制作,中間呈球形,內(nèi)充一定數(shù)量的汞,工作時(shí)由兩個(gè)電極間放電,引起水銀蒸發(fā),球內(nèi)氣壓迅速升高,當(dāng)水銀完全蒸發(fā)時(shí),可達(dá)50~70個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓力,這一過程一般約需5~15min。超高壓汞燈的發(fā)光是電極間放電使水銀分子不斷解離和還原過程中發(fā)射光量子的結(jié)果。它發(fā)射很強(qiáng)的紫外和藍(lán)紫光,足以激發(fā)各類熒光物質(zhì),因此,為熒光顯微鏡普遍采用。

超高壓汞燈也散發(fā)大量熱能。因此,燈室必須有良好的散熱條件,工作環(huán)境溫度不宜太高。

新型超高壓汞燈在使用初期不需高電壓即可引燃,使用一些時(shí)間后,則需要高壓啟動(dòng)(約為15000V),啟動(dòng)后,維持工作電壓一般quanxiangyun.cn/zhicheng/為50~60V,工作電流約4A左右。200W超高壓汞燈的平均壽命,在每次使用2h的情況下約為200h,開動(dòng)一次工作時(shí)間愈短,則壽命愈短,如開一次只工作20min,則壽命降低50%。因此,使用時(shí)盡量減少啟動(dòng)次數(shù)。燈泡在使用過程中,其光效是逐漸降低的。燈熄滅后要等待冷卻才能重新啟動(dòng)。點(diǎn)燃燈泡后不可立即關(guān)閉,以免水銀蒸發(fā)不完全而損壞電極,一般需要等15min。由于超高壓汞燈壓力很高,紫外線強(qiáng)烈,因此燈泡必須置燈室中方可點(diǎn)燃,以免傷害眼睛和發(fā)生爆炸時(shí)造成操作。

超高壓汞燈(100W或200W)光源的電路和包括變壓、鎮(zhèn)流、啟動(dòng)幾個(gè)部分。在燈室上有調(diào)節(jié) 燈泡發(fā)光中心的系統(tǒng),燈泡球部后面安裝有鍍鋁的凹面反射鏡,前面安裝有集光透鏡。

國產(chǎn)超高壓汞燈GCQ-200型性能良好,可以代替HBO-200等型的進(jìn)口燈泡,平均壽命在200h以上,價(jià)格也比較低。

我國研制的一種簡易輕便型高色溫溴鎢熒光光源裝置,體積小,重量輕,功率小,交、直流兩用(自帶直流電源),易于攜帶,使用方便,已推廣應(yīng)用。

(二)濾色系統(tǒng)

濾色系統(tǒng)是熒光顯微鏡的重要部位,由激發(fā)濾板和壓制濾板組成。濾板型號(hào),各廠家名稱常不統(tǒng)一。濾板一般都以基本色調(diào)命名,前面字母代表色調(diào),后面字母代表玻璃,數(shù)字代表型號(hào)特點(diǎn)。如德國產(chǎn)品(Schott)BG12,就是種藍(lán)色玻璃,B是藍(lán)色的第一個(gè)字母,G是玻璃的第一個(gè)字母;我國產(chǎn)品的名稱已統(tǒng)一用拼音字母表示,如相當(dāng)于BG12的藍(lán)色濾板名為QB24,Q是青色(藍(lán)色)拼音的第一個(gè)字母,B是玻璃拼音的第一個(gè)字母。不過有的濾板也可以透光分界濾長命名,如K530,就是表示壓制濾長530nm以下的光而透過530nm以上的光。還有的廠家的濾板完全以數(shù)字命名,如美國Corning廠的NO:5-58,即相當(dāng)于BG12。

用于熒光顯微鏡的主要濾板如表3-1。

表3-1 熒光顯微鏡常用濾板型號(hào)和透光特點(diǎn)

基本色調(diào)相應(yīng)名稱2mm厚透光范圍(峰值)nm
上海電器元件廠德國(Schott)蘇聯(lián)日本
黑紫ZWB-1UG-1yΦC-2DV-1300~400(365)
黑紫ZWB-2UG-5yΦC-1 280~240(360)
靛藍(lán)ZB-2BG-1ΦC-1BG-1300~500(380)
靛藍(lán)ZB-3BG-3CC-4BG-3260~520(400)
靛藍(lán)QB-24BG-12CC-8BG-12310~570(420)
淡藍(lán)QB-10BG-38C3C-5 310~720(460)
 QB-12 -8  
   -11  
橙黃CB-3OG-1(K530)OC-11OG-1530以上
橙黃JB-8OG-4(K510)ЖC-18FY-5510以上
綠橙JB-7GG-11(K490)ЖC-17FY-3480以上
    FY-4 
淡綠JB-4GG-3(K430)жC-11US-10420以上

引自:五九一節(jié) 五部隊(duì)編:熒光顯微術(shù),見參考資料)

1.激發(fā)濾板  根據(jù)光源和熒光色素的特點(diǎn),可選用以下三類激發(fā)濾板,提供一定波長范圍的激發(fā)光。

紫外光激發(fā)濾板:此濾板可使400nm以下的紫外光透過,阻擋400nm以上的可見光通過。常用型號(hào)為UG-1或UG-5,外加一塊BG-38,以除去紅色尾波。

紫外藍(lán)光激發(fā)濾板:此濾板可使300~450nm范圍內(nèi)的光通過。常用型號(hào)為ZB-2或ZB-3,外加BG-38。

紫藍(lán)光激發(fā)濾板:它可使350~490nm的光通過。常用型號(hào)為QB24(BG12)。

最大吸收峰在500nm以上者的熒光素(如羅達(dá)明色素)可用藍(lán)綠濾板(如B-7)激發(fā)。

近年開始采用金屬膜干涉濾板,由于針對(duì)性強(qiáng),波長適當(dāng),因而激發(fā)效果比較玻璃濾更好。如西德Leitz廠的FITC專用KP490濾板和羅達(dá)明的S546綠色濾板,均遠(yuǎn)比玻璃濾板效果好。

激發(fā)濾板分薄厚兩種,一般暗視野選用薄濾板,亮視野熒光顯微鏡可選用厚一些;疽笫且垣@得最明亮的熒光和最好的背景為準(zhǔn)。

2.壓制濾板 壓制濾板的作用是完全阻擋激發(fā)光通過,提供相應(yīng)濾長范圍的熒光。與激發(fā)濾板相對(duì)應(yīng),常用以下3種壓制濾板:

紫外光壓制濾板:可通過可見光、阻擋紫外光通過。能與UG-1或UG-5組合。常用GG-3K430或GG-6K460。

紫藍(lán)光壓制濾板:能通過510nm以上濾長的熒光(綠到紅),能與BG-12組合。通常用OG-4K510或OG-1K530。

紫外紫光壓制濾板:能通過460nm以上波長的熒光(藍(lán)到紅),可與BG-3組合,常用OG-11K470AK 490,K510。

(三)反光鏡

反光鏡的反光層一般是鍍鋁的,因?yàn)殇X對(duì)紫外光和可見光的藍(lán)紫區(qū)吸收少,反射達(dá)90%以上,而銀的反射只有70%;一般使用平面反光鏡。

(四)聚光鏡

專為熒光顯微鏡設(shè)計(jì)制作的聚光器是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成。分明視野聚光器的暗視野聚光器兩種。還有相差熒光聚光器。

1.明視野聚光器  在一般熒光顯微鏡上多用明視野聚光器,它具有聚光力強(qiáng),使用方便,特別適于低、中倍放大的標(biāo)本觀察。

2.暗視野聚光器  暗視野聚光器在熒光顯微鏡中的應(yīng)用日益廣泛。因?yàn)榧ぐl(fā)光不直接進(jìn)入物鏡,因而除散射光外,激發(fā)光也不進(jìn)入目鏡,可以使用薄的激發(fā)濾板,增強(qiáng)激發(fā)光的強(qiáng)度,壓制濾板也可以很薄,因紫外光激發(fā)時(shí),可用無色濾板(不透過紫外)而仍然產(chǎn)生黑暗的背景。從而增強(qiáng)了熒光圖像的亮度和反襯度,提高了圖像的質(zhì)量,觀察舒適,可能發(fā)現(xiàn)亮視野難以分辨的細(xì)微熒光顆粒。

3.相差熒光聚光器  相差聚光器與相差物鏡配合使用,可同時(shí)進(jìn)行相差和熒光聯(lián)合觀察,既能看到熒光圖像,又能看到相差圖像,有助于熒光的定位準(zhǔn)確。一般熒光觀察很少需要這種聚光器。

(五)物鏡

各種物鏡均可應(yīng)用,但最好用消色差的物鏡,因其自體熒光極微且透光性能(波長范圍)適合于熒光。由于圖像在顯微鏡視野中的熒光亮度與物鏡鏡口率的平方成正比,而與其放大倍數(shù)成反比,所以為了提高熒光圖像的亮度,應(yīng)使用鏡口率大的物鏡。尤其在高倍放大時(shí)其影響非常明顯。因此對(duì)熒光不夠強(qiáng)的標(biāo)本,應(yīng)使用鏡口率大的物鏡,配合以盡可能低的目鏡(4×,5×,6.3×等)。

(六)目鏡

在熒光顯微鏡中多用低倍目鏡,如5×和6.3×。過去多用單筒目鏡,因?yàn)槠淞炼缺入p筒目鏡高一倍以上,但目前研究型熒光顯微鏡多用雙筒目鏡,觀察很方便。

(七)落射光裝置

新型的落射光裝置是從光源來的光射到干涉分光濾鏡后,波長短的部分(紫外和紫藍(lán))由于濾鏡上鍍膜的性質(zhì)而反射,當(dāng)濾鏡對(duì)向光源呈45。傾斜時(shí),則垂直射向物鏡,經(jīng)物鏡射向標(biāo)本,使標(biāo)本受到激發(fā),這時(shí)物鏡直接起聚光器的作用。同時(shí),濾長長的部分(綠、黃、紅等),對(duì)濾鏡是可透的,因此,不向物鏡方向反射,濾鏡起了激發(fā)濾板作用,由于標(biāo)本的熒光處在可見光長波區(qū),可透過濾鏡而到達(dá)目鏡觀察,熒光圖像的亮度隨著放大倍數(shù)增大而提高,在高放大時(shí)比透射光源強(qiáng)。它除具有透射式光源的功能外,更適用于不透明及半透明標(biāo)本,如厚片、濾膜、菌落、組織培養(yǎng)標(biāo)本等的直接觀察。近年研制的新型熒光顯微鏡多采用落射光裝置,稱之為落射熒光顯微鏡。

二、熒光顯微鏡標(biāo)本制作要求

(一)載玻片

載玻片厚度應(yīng)在0.8~1.2mm之間,太厚的坡片,一方面光吸收多,另一方面不能使激發(fā)光在標(biāo)本上聚集。載玻片必須光潔,厚度均勻,無明顯自發(fā)熒光。有時(shí)需用石英玻璃載玻片。

(二)蓋玻片

蓋玻片厚度在0.17mm左右,光潔。為了加強(qiáng)激發(fā)光,也可用干涉蓋玻片,這是一種特制的表面鍍有若干層對(duì)不同波長的光起不同干涉作用的物質(zhì)(如氟化鎂)的蓋玻片,它可以使熒光順利通過,而反射激發(fā)光,這種反射的激發(fā)光女可激發(fā)標(biāo)本。

(三)標(biāo)本

組織切片或其他標(biāo)本不能太厚,如太厚激發(fā)光大部分消耗在標(biāo)本下部,而物鏡直接觀察到的上部不充分激發(fā)。另外,細(xì)胞重迭或雜質(zhì)掩蓋,影響判斷。

(四)封裱劑

封裱劑常用甘油,必須無自發(fā)熒光,無色透明,熒光的亮度在pH8.5~9.5時(shí)較亮,不易很快褪去。所以,常用甘油和0.5mol/l pH9.0~9.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液作封裱劑。

(五)鏡油

一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀察標(biāo)本時(shí),必須使用鏡油,最好使用特制的無熒光鏡油,也可用上述甘油代替,液體石蠟也可用,只是折光率較低,對(duì)圖像質(zhì)量略有影響。

三、使用熒光顯微鏡的注意事項(xiàng)

(1)嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進(jìn)行操作,不要隨意改變程序。

(2)應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查。進(jìn)入暗室后,接上電源,點(diǎn)燃超高壓汞燈5~15min,待光源發(fā)出強(qiáng)光穩(wěn)定后,眼睛完全適應(yīng)暗室,再開始觀察標(biāo)本。

(3)防止紫外線對(duì)眼睛的損害,在調(diào)整光源時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡。

(4)檢查時(shí)間每次以1~2h為宜,超過90min,超高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降,熒光減弱;標(biāo)本受紫外線照射3~5min后,熒光也明顯減弱;所以,最多不得超過2~3h。

(5)熒光顯微鏡光源壽命有限,標(biāo)本應(yīng)集中檢查,以節(jié) 省時(shí)間,保護(hù)光源。天熱時(shí),應(yīng)加電扇散熱降溫,新?lián)Q燈泡應(yīng)從開始就記錄使用時(shí)間。燈熄滅后欲再用時(shí),須待燈泡充分冷卻后才能點(diǎn)燃。一天中應(yīng)避免數(shù)次點(diǎn)燃光源。

(6)標(biāo)本染色后立即觀察,因時(shí)間久了熒光會(huì)逐漸減弱。若將標(biāo)本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存,可延緩熒光減弱時(shí)間,防止封裱劑蒸發(fā)。

(7)熒光亮度的判斷標(biāo)準(zhǔn):一般分為四級(jí),即“一”—無或可見微弱熒光。“+”—僅能見明確可見的熒光!++”—可見有明亮的熒光!+++”—可見耀眼的熒光。

四、熒光圖像的記錄方法

熒光顯微鏡所看到的熒光圖像,一是具有形態(tài)學(xué)特征,二是具有熒光的顏色和亮度,在判斷結(jié)果時(shí),必須將二者結(jié)合起來綜合判斷。結(jié)果記錄根據(jù)主觀指標(biāo),即憑工作者目力觀察。作為一般定性觀察,基本上可靠的。隨著技術(shù)科學(xué)的發(fā)展,在不同程度上采用客觀指標(biāo)記錄判斷結(jié)果,如用細(xì)胞分光亮度計(jì),圖像分析儀等儀器。但這些儀器記錄的結(jié)果,也必須結(jié)quanxiangyun.cn/rencai/合主觀的判斷。

熒光顯微鏡攝影技術(shù)對(duì)于記錄熒光圖像十分必要,由于熒光很易褪色減弱,要即時(shí)攝影記錄結(jié)果。方法與普通顯微攝影技術(shù)基本相同。只是需要采用高速感光膠片如ASA200以上或24。以上。因紫外光對(duì)熒光猝滅作用大,如FITC的標(biāo)記物,在紫外光下照射30s,熒光亮度降低50%。所以,曝光速度太慢,就不能將熒光圖像拍攝下來。一般研究型熒光顯微鏡都有半自動(dòng)或全自動(dòng)顯微攝影系統(tǒng)裝置。

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