免疫學(xué)和免疫學(xué)檢驗(yàn):第三節(jié)　化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定

化學(xué)發(fā)光反應(yīng)參與的免疫測(cè)定分為二種類(lèi)型。第一種是以發(fā)光劑作為酶免疫測(cè)定的底物，通過(guò)發(fā)光反應(yīng)增強(qiáng)測(cè)定的敏感性；第二種是以發(fā)光劑作為抗體或抗原的標(biāo)記物，直接通過(guò)發(fā)光反應(yīng)檢測(cè)標(biāo)本中抗原或抗體的含量。

一、化學(xué)發(fā)光酶免疫測(cè)定

從標(biāo)記免疫測(cè)定來(lái)看，化學(xué)發(fā)光酶免疫測(cè)定（chemiluminescentenzymeimmunoasssay，CLEIA)應(yīng)屬酶免疫測(cè)定。測(cè)定中2次抗原抗體反應(yīng)步驟均與酶免疫測(cè)定相同，僅最后一步酶反應(yīng)所用底物為發(fā)光劑，通過(guò)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)發(fā)出的光在特定的儀器上進(jìn)行測(cè)定。兩種常用的標(biāo)記酶，辣根過(guò)氧化物酶（HRP)和堿性磷酸酶（AP)均有其發(fā)光底物，由此建立的CLEIA均在臨床檢驗(yàn)中應(yīng)用。

（一)HRP標(biāo)記的CLEIA

常用的底物為魯米諾或其衍生物。魯米諾的氧化反應(yīng)在堿性緩沖液中進(jìn)行，通常以0.1mol/LpH8.6Tris緩沖液作底物液，魯米諾和H₂O₂在無(wú)HRP催化時(shí)也能緩慢自發(fā)發(fā)光，而在最后光強(qiáng)度測(cè)定中造成空白干擾，因而宜分別配制成2瓶試劑溶液，只在用前即刻混合。

HRP催化魯米諾氧化的反應(yīng)可被某些酚試劑（如鄰－碘酚)或螢火蟲(chóng)熒光素酶等加強(qiáng)。加強(qiáng)劑的作用是增強(qiáng)發(fā)光和延長(zhǎng)發(fā)光時(shí)間，由此可提高敏感度。

（二)AP標(biāo)記的CLEIA

在以AP為標(biāo)記酶的CLEIA中，應(yīng)用的底物為adamantyldioxetasephosphate，有不少衍生物的商品試劑如PPD可供應(yīng)用。發(fā)光反應(yīng)的反應(yīng)式如下：

二、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫測(cè)定

化學(xué)發(fā)光quanxiangyun.cn/rencai/標(biāo)記免疫測(cè)定亦稱(chēng)化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定（chemiluminescentimmunoassay，CLIA)，是用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體的一類(lèi)免疫測(cè)定方法。用作標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光劑應(yīng)符合以下幾個(gè)條件：①能參與化學(xué)發(fā)光反應(yīng)；②與抗原或抗體偶聯(lián)后能形成穩(wěn)定的結(jié)合物試劑；③偶聯(lián)后仍保留高的量子效應(yīng)和反應(yīng)動(dòng)力；④應(yīng)不改變或極少改變被標(biāo)記物的理化特性，特別是免疫活性。魯米諾類(lèi)和吖啶酯類(lèi)發(fā)光劑等均是常用的標(biāo)記發(fā)光劑。

魯米諾類(lèi)的發(fā)光反應(yīng)須有催化劑（例如過(guò)氧化物酶)催化，且與蛋白質(zhì)或肽結(jié)合后其發(fā)光作用減弱，因此魯米諾類(lèi)在CLEIA中是很好的底物，但已較少用于CLIA的標(biāo)記。吖啶酯類(lèi)對(duì)CLIA更為適用，其顯著的優(yōu)點(diǎn)是：①氧化反應(yīng)不需催化劑，只要堿性環(huán)境中就可以進(jìn)行。反應(yīng)物在加入H₂O₂后再加氫化鈉溶液，發(fā)光反應(yīng)迅速，本底低。②在氧化反應(yīng)過(guò)程中，結(jié)合物被分解，因此游離的吖啶酯的發(fā)光不受抑制。試劑穩(wěn)quanxiangyun.cn定性好。

三、電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定

在電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定（electrochemluminescenceimmunoassay，ECLI)中應(yīng)用的標(biāo)記物為電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的底物三聯(lián)吡啶釕，其衍生物N-羥基琥珀酰胺（NHS)酯可通過(guò)化學(xué)反應(yīng)與抗體或不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的抗原分子結(jié)合，制成標(biāo)記的抗體或抗原。ECLI的測(cè)定模式與ELISA相似，分二個(gè)步驟進(jìn)行。以雙抗體夾心法測(cè)定抗原為例，第一步在試管中進(jìn)行，反應(yīng)物為Ru(bpy)₃²⁺標(biāo)記的抗體、吸附在磁性微球上的固相抗體以及受檢的標(biāo)本，反應(yīng)式如圖18-2。

圖18-2 ECLI中的抗原抗體反應(yīng)

反應(yīng)后除由標(biāo)記抗體、固相抗體與標(biāo)本中的抗原形成的夾心復(fù)合物外，尚有多余的標(biāo)記抗體和固相抗體。第二步是將反應(yīng)液輸入特殊的檢測(cè)儀器的反應(yīng)室中（圖18-3)，隨即用含三丙胺（TPA)的緩沖液沖洗。反應(yīng)室電極下有磁鐵。含磁性微球的夾心復(fù)合物及游離的固相抗體被吸附在電極表面，游離的標(biāo)記抗體隨沖洗液流出。此時(shí)在反應(yīng)室中即發(fā)生如圖18-1的電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。發(fā)出的光由光電倍增管轉(zhuǎn)為信號(hào)，通過(guò)電信號(hào)的測(cè)定反映標(biāo)本中抗原的含量。

圖18-3 ECLI中的ECL反應(yīng)

ECLI具有以下優(yōu)點(diǎn)：①標(biāo)記物在再循環(huán)利用，使發(fā)光時(shí)間更長(zhǎng)、強(qiáng)度更高、易于測(cè)定；②敏感度高，可達(dá)pg/ml或pmol水平；③線(xiàn)性范圍寬，＞10⁴；④反應(yīng)時(shí)間短，20min以?xún)?nèi)可完成測(cè)定；⑤試劑穩(wěn)定性好，2～5℃可保持一年以上。

四、在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用

放射免疫分析因標(biāo)記物的放射性在應(yīng)用中存在不少問(wèn)題。為替代這一廣被采用的測(cè)定方法，近年來(lái)創(chuàng)立了多種新的標(biāo)記免疫技術(shù)。化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定具有明顯的優(yōu)越性：①敏感度高，甚至超過(guò)RIA；②精密度和準(zhǔn)確性均可與RIA相比；③試劑穩(wěn)定，無(wú)毒害；④測(cè)定耗時(shí)短；⑤測(cè)定項(xiàng)目多；⑥已發(fā)展成自動(dòng)化測(cè)定系統(tǒng)。因此化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中不僅能取代RIA，而且可得到更為廣泛的應(yīng)用。