武漢大學(xué)微生物講義

                       實驗三 

[目的要求]

    通過對高氏Ⅰ號培養(yǎng)基的配制、掌握配制合成培養(yǎng)基的一般方法。

[實驗原理]

    高氏Ⅰ號培養(yǎng)基是用來培養(yǎng)和觀察放線菌形態(tài)特征的合成培養(yǎng)基。如果加入適量的抗菌藥物(如各種抗生素、酚等)，則可用來分離各種放線菌。此合成培養(yǎng)基的主要特點是含有多種化學(xué)成分已知的無機鹽，這些無機鹽可能相互作用而產(chǎn)生沉淀。此外，合成培養(yǎng)基有的還要補加微量元素。

[教學(xué)內(nèi)容]

    高氏Ⅰ號培養(yǎng)基的制備

實驗四 

[目的要求]

通過對分離真菌的馬丁氏(Martin)培養(yǎng)基配制、掌握選擇培養(yǎng)基的配制方法，并確選擇的原理。

[實驗原理]

馬丁氏培養(yǎng)基是一種用來分離真菌的選擇性培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基的特點是培養(yǎng)基中加入的孟加拉紅和鏈霉素能有效的抑制細菌和放線功菌的生長，而對真菌無抑制作用，因而真菌在這種培養(yǎng)基上可以得到優(yōu)勢生長，從而達到分離真菌的目的。

[教學(xué)內(nèi)容]

     馬丁氏培養(yǎng)基的制備

實驗五 

[目的要求]

1.了解干熱滅菌的原理和應(yīng)用范圍。

2.學(xué)習(xí)干熱滅菌的操作技術(shù)。

[實驗原理]

干熱滅菌是利用高溫使微生物細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的。細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固性與其本身的含水量有關(guān)，在菌體受熱時，當環(huán)境和細胞內(nèi)含水量越大，則蛋白質(zhì)凝固就越快，反之含水量越小，凝固緩慢。

[教學(xué)內(nèi)容]

干熱滅菌

實驗六

[目的要求]

1.了解高壓蒸汽滅菌的基本原理及應(yīng)用范圍。

2.學(xué)習(xí)高壓蒸汽滅菌的操作方法。

[實驗原理]

高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。從而使沸點增高，得到高于100℃的溫度。導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的。

[教學(xué)內(nèi)容]

高壓蒸汽滅菌

實驗七 

[目的要求]

了解紫外線滅菌的原理和方法

[實驗原理]

紫外線滅菌是用紫外線燈進行的。波長為200-300nm的紫外線都有殺菌能力，其中以260nm的殺菌力最強。在波長一定的條件下，紫外線的殺菌效率與強度和時間的乘積成正比。紫外線殺菌機制主要是因為它誘導(dǎo)了胸腺嘧啶二聚體的形成和DNA鏈的交聯(lián)，從而抑制了DNA的復(fù)制。另一方面，由于輻射能使空氣中的氧電離成［O］，再使O2氧化生成自臭氧(O3)或使水(H2O)氧化生成過氧化氫(H2O2)。O3和H2O2均有殺菌作用。

[教學(xué)內(nèi)容]

紫外線滅菌

實驗八

[目的要求]

了解過濾除菌的原理；掌握微孔濾膜過濾除菌的方法。

[實驗原理]

過濾除菌是通過機械作用濾去液體或氣體中細菌的方法。根據(jù)不同的需要選用不同的濾器和濾板材料。此法除菌的最大優(yōu)點是可以不破壞溶液中各種物質(zhì)的化學(xué)成分，但由于濾量有限，所以一般只適用于實驗室中小量溶液的過濾除菌。

[教學(xué)內(nèi)容]

微孔濾膜過濾除菌

實驗九 

[目的要求]

掌握倒平板的方法和幾種常用的分離純化微生物的基本操作技術(shù)。

[實驗原理]

從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。常用的方法有：1).簡易單細胞挑取法; 2).平板分離法。

土壤是微生物生活的大本營，它所含微生物無論是數(shù)量還是種類都是極其豐富的。因此土壤是微生物多樣性的重要場所，是發(fā)掘微生物資源的重要基地，可以從中分離、純化得到許多有價值的菌株。

[教學(xué)內(nèi)容]

微生物的分離與純化

實驗十 

[目的要求]

1.了解不同的微生物在斜面上、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中的生長特征。

2.進一步熟練和掌握微生物無菌操作技術(shù)。

[實驗原理]

微生物的培養(yǎng)特征是指微生物在固體培養(yǎng)基上、半固體和液體培養(yǎng)基中生長后所表現(xiàn)出的群體形態(tài)特征。不同的微生物有其固有的培養(yǎng)特征，這些特征一般用固體、半固體和液體培養(yǎng)基來進行檢測。

檢測微生物的培養(yǎng)特征時，接種和培養(yǎng)過程中必須保證不被其他微生物所污染，因此，除工作環(huán)境要求盡可能地避免或減少雜菌污染外，熟練地掌握各種無菌操作接種技術(shù)是很重要。

[教學(xué)內(nèi)容]

微生物的培養(yǎng)特征

                          實驗十一

[目的要求]

1.學(xué)習(xí)微生物涂片、染色的基本技術(shù)，掌握細菌的簡單染色法。

2.初步認識細菌的形態(tài)特征。

3.鞏固顯微鏡(油鏡)的使用方法和無菌操作技術(shù)。

[實驗原理]

簡單染色法是利用單一染料對細菌進行染色的一種方法。此法操作簡便，適用于菌體一般形狀和細菌排列的觀察。常用堿性染料進行簡單染色，這是因為：在中性、堿性或弱酸性溶液中，細菌細胞通常帶負電荷，而堿性染料在電離時，其分子的染色部分帶正電荷(酸性染料電離時，其分子的染色部分帶正電荷)，因此堿性染料的染色部分很容易與細菌結(jié)合使細菌著。染色后的細菌細胞與背景形成鮮明的對比，在顯微鏡下更易于識別。常用作簡單染色的染料有：美藍、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅等。

當細菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH下降時，細菌所帶正電荷增加，此時可用伊紅、酸性復(fù)紅或剛果紅等酸性染料染色。

[教學(xué)內(nèi)容]

細菌的簡單染色法

實驗十二

[目的要求]

1.  學(xué)習(xí)并初步掌握革蘭氏染色法。

2.  了解革蘭氏染色法的原理及其在細菌分類鑒定中的重要性。

[實驗原理]

革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家Christain Gram氏創(chuàng)立的，而后一些學(xué)者在此礎(chǔ)上作了某些改進。革蘭氏染色法是細菌學(xué)中最重要的鑒別染色法。

[教學(xué)內(nèi)容]

革蘭氏染色法

                         實驗十三

[目的要求]

1.  學(xué)習(xí)并初步掌握鞭毛染色法，觀察細菌鞭毛的形態(tài)特征。

2.  學(xué)習(xí)用壓滴法和懸滴法觀察細菌的運動性。

[實驗原理]

鞭毛是細菌的運動“器官”，細菌是否具有鞭毛，以及鞭毛著生的位置和數(shù)目是細菌的一項重要形態(tài)特征。細菌的鞭毛很纖細，其直徑通常為0.01～0.02微米，所以，除了很少數(shù)能形成鞭毛束(由許多根鞭毛構(gòu)成)的細菌可以用相差顯微鏡直接觀察到鞭毛束的存在外，一般細菌的鞭毛均不能用光學(xué)顯微鏡直接觀察到，而只能用電子顯微鏡觀察。要用普通光學(xué)顯微鏡觀察細菌的鞭毛，必須用鞭毛染色法。

[教學(xué)內(nèi)容]

    鞭毛染色法及細菌運動性的觀察

實驗十四

[目的要求]

1．  學(xué)習(xí)并掌握觀察放線菌形態(tài)的基本方法。

2．  初步了解放線菌的形態(tài)特征。

[實驗原理]

放線菌是指能形成分枝絲狀體或菌絲體的一類革蘭氏陽性細菌。常見放線菌大多能形成菌絲體，緊貼培養(yǎng)基表面或深入培養(yǎng)基內(nèi)生長的叫基內(nèi)菌絲(簡稱“基絲”)，基絲生長到一定階段還能向空氣中生長出氣生菌絲(簡稱“氣絲”)，并進一步分化產(chǎn)生孢子絲及孢子。為了觀察放線菌的形態(tài)特征，人們設(shè)計了各種培養(yǎng)和觀察方法，這些方法的主要目的是為了盡可能保持放線菌自然生長狀態(tài)下的形態(tài)特征。本實驗介紹其中幾種常用方法。

[教學(xué)內(nèi)容]

放線菌形態(tài)的觀察

實驗十五

[目的要求]

學(xué)習(xí)并掌握用測微尺測定微生物大小的方法。增強微生物細胞大小的感性認識。

[實驗原理]

微生物細胞的大小是微生物基本的形態(tài)特征，也是分類鑒定的依據(jù)之一。微生物大小

的測定在顯微鏡下，借助于特殊的測量工具—測微尺，包括目鏡測微尺和鏡臺測微尺。

[教學(xué)內(nèi)容]

  微生物大小的測定

實驗十五 

[目的要求]

1.  觀察酵母菌的形態(tài)及出芽生殖方式，學(xué)習(xí)區(qū)分酵母菌死活細胞的實驗方法。

2.  掌握酵母菌的一般形態(tài)特征及其與細菌的區(qū)別。

[實驗原理]

酵母菌是不運動的單細胞真核微生物，其大小通常比常見細菌大幾倍甚至十幾倍。

美藍是一種無毒性的染料，它的氧化型呈藍色，還原型無色。用美藍對酵母的活細胞進行染色時，由于細胞的新陳代謝作用，細胞內(nèi)具有較強的還原能力，能使美藍由藍色的氧化型變?yōu)闊o色的還原型，因此，具有還原能力的酵母活細胞是無色的、而死細胞或代謝作用微弱的衰老細胞則呈藍色或淡藍色，借此即可對酵母菌的死細胞和活細胞進行鑒別。

[教學(xué)內(nèi)容]

酵母菌的形態(tài)觀察及死活細胞的鑒別

                         實驗十六

[目的要求]

學(xué)習(xí)并掌握觀察霉菌形態(tài)的基本方法；了解四類常見霉菌的基本形態(tài)特征。

[實驗原理]

霉菌可產(chǎn)生復(fù)什分枝的菌絲體，分基內(nèi)菌絲和氣生菌絲，氣生菌絲生長到一定階段分化產(chǎn)生繁殖菌絲，由繁殖菌絲產(chǎn)生孢子。霉菌菌絲體(尤其是繁殖菌絲)及孢子的形態(tài)特征是識別不同種類霉菌的重要依據(jù)。霉菌菌絲和孢子的寬度通常比細菌和放線菌粗得多(約為3～10微米)，常是細菌菌體寬度的幾倍至幾十倍，因此，用低倍顯微鏡即可觀察。

[教學(xué)內(nèi)容]

霉菌的形態(tài)觀察

實驗十七

  [目的要求]

1.明確血球計數(shù)板計數(shù)的原理

2.掌握使用血球計數(shù)板進行微生物計數(shù)的方法。

[實驗原理]

顯微鏡直接計數(shù)法是將小量待測樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻上(又稱計菌器)，于顯微鏡下直接計數(shù)的一種簡便、快速、直觀的方法。

[教學(xué)內(nèi)容]

顯微鏡直接計數(shù)法

                      實驗十八 

[目的要求]

學(xué)習(xí)平板菌落計數(shù)的基本原理和方法。

[實驗原理]

平板菌落計數(shù)法是將待測樣品經(jīng)適當稀釋之后，其中的微生物充分分散成單個細胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經(jīng)過培養(yǎng)，由每個單細胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落。為了清楚地闡述平板菌落計數(shù)的結(jié)果，現(xiàn)在已傾向使用菌落形成單位(colony -forming units, cfu)而不以絕對菌落數(shù)來表示樣品的活菌含量。

[教學(xué)內(nèi)容]

平板菌落計數(shù)法

實驗十九 

[目的要求]

1.了解光電比濁計數(shù)法的原理

2.學(xué)習(xí)、掌握光電比濁計數(shù)法的操作方法。

[實驗原理]

當光線通過微生物菌懸液時，由于菌體的散射及吸收作用使光線的透過量降低。在一定的范圍內(nèi)，微生物細胞濃度與透光度成反比，與光密度成正比，而光密度或透光度可以由光電池精確測出(圖Ⅷ-4)。因此，可用一系列已知菌數(shù)的菌懸液測定光密度，作出光密度--菌數(shù)標準曲線。因此，對于不同微生物的菌懸液進行光電比濁計數(shù)應(yīng)采用相同的菌株和培養(yǎng)條件制作標準曲線。

[教學(xué)內(nèi)容]

光電比濁計數(shù)法

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