| 公開(公告)號 | CN1995343A |
| 公開(公告)日 | 2007.07.11 |
| 申請(專利)號 | CN200610168056.3 |
| 申請日期 | 2006.12.25 |
| 專利名稱 | 制備可溶高活性重組納豆激酶的方法 |
| 主分類號 | C12N15/09(2006.01)I |
| 分類號 | C12N15/09(2006.01)I;C12N15/54(2006.01)I;C12N9/12(2006.01)I;C12N1/21(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 李慧潔;楊秀桃 |
| 發(fā)明(設(shè)計)人 | 李慧潔;楊秀桃 |
| 地址 | 471003河南省洛陽市澗西區(qū)安徽路1號院1棟1門301 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 太原市科瑞達(dá)專利代理有限公司 |
| 代理人 | 劉寶賢 |
| 國省代碼 | 河南;41 |
| 主權(quán)項 | 一種制備可溶高活性重組納豆激酶的方法，其特征在于： 構(gòu)建含有前導(dǎo)肽序列的納豆激酶基因克隆，加入GST蛋白標(biāo)簽和PDI的分子伴侶幫助目的基因在大腸桿菌中高效表達(dá)，在序列中內(nèi)嵌入HIS標(biāo)簽和蛋白酶切位點(diǎn)幫助目的蛋白高效提純，以及生物活性的鑒定，具體方法為： 1)以Bacillus Subtilis Natto菌體為模板，根據(jù)納豆激酶(Nattokinase，簡稱NK)全長序列設(shè)計引物，通過PCR的方法獲得包含前導(dǎo)肽的全長納豆激酶基因，稱為proNK；在proNK基因的3′末端增加HIS標(biāo)簽序列(六個連續(xù)的組氨酸，HIS6)，再將proNK加HIS標(biāo)簽的基因克隆進(jìn)入pGEX-6P載體；接著利用PCR將分子伴侶PDI的全長基因克隆出來接到proNK基因的3′末端；在PDI基因的前端加入Prescission Protease(簡稱PPase)蛋白酶切位點(diǎn)序列(序列用pp表示)，這樣組裝成為高效表達(dá)載體pGEX-6p-proNK-HIS6-pp-PDI，簡稱6pNHP；相應(yīng)表達(dá)出的重組蛋白為GST-pp-proNK-HIS6-pp-PDI； 2)6pNHP轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosseta，用IPTG誘導(dǎo)重組基因的表達(dá)；同時將含有PPase的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Rosseta菌株，一起誘導(dǎo)表達(dá)；然后將兩種菌體按比例收集在一起； 3)用含有10％甘油的Tris緩沖液重懸細(xì)菌，超聲破碎，離心收集上清液；調(diào)整PH值，低溫振蕩使PPase將重組蛋白酶切完全，釋放出proNK蛋白，從而得到高濃度的含有納豆激酶的溶液；進(jìn)行蛋白定量分析和活性測定； 4)將含有納豆激酶的溶液進(jìn)行純化處理。 |
| 摘要 | 一種制備可溶高活性重組納豆激酶的方法，特別是涉及納豆激酶表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)和純化工藝，解決了一般的基因工程重組表達(dá)的方法導(dǎo)致納豆激酶以包涵體的形式出現(xiàn)在表達(dá)產(chǎn)物當(dāng)中的問題。本發(fā)明方法包括表達(dá)全長的帶有前導(dǎo)肽的納豆激酶基因以提高活性，加入重要的分子伴侶PDI幫助蛋白正確折疊、利用GST標(biāo)簽提高蛋白可溶性、利用硫酸銨沉淀法快速提純產(chǎn)品、加入HIS蛋白標(biāo)簽幫助產(chǎn)物進(jìn)一步純化等等。這樣的納豆激酶產(chǎn)品純度高，產(chǎn)量高，活性高，成本低，生產(chǎn)工藝簡單，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。產(chǎn)物可以制作藥物或者口服保健品，利于向大眾推廣，成為新一代的溶栓產(chǎn)品。 |
| 國際公布 |
