公開(公告)號
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CN1188516C
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公開(公告)日
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2005.02.09
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申請(專利)號
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CN99119166.8
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申請日期
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1999.09.17
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專利名稱
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一種重組納豆激酶的編碼核苷酸序列及該酶的制備方法
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主分類號
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C12N9/12
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分類號
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C12N9/12;C12N15/70;C12N15/54;A61K38/45;A61P7/02
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分案原申請?zhí)? |
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優(yōu)先權
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申請(專利權)人
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常榮山
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發(fā)明(設計)人
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常榮山
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地址
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100080 北京市海淀區(qū)蘇州街18號長遠天地A2座612室
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頒證日
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國際申請
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進入國家日期
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專利代理機構
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代理人
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國省代碼
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北京;11
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主權項
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一種制備重組納豆激酶的方法,包括納豆激酶基因克隆的構建,在大腸桿菌中的表達,工程菌的發(fā)酵,表達產物重組納豆激酶的純化以及其生物活性的測定,其特征在于:(1)以枯草桿菌BacillussubtilisnottoAsl.1086菌體總DNA為模板,參考枯草桿菌中編碼納豆激酶EC.3.4.262的NAT基因序列設計引物,通過PCR方法直接擴增納豆激酶基因,納豆激酶基因克隆進pGEM-T載體后,經序列分析證實,然后與含有cIta857基因,PrPL啟動子以及rrnB基因轉錄終止信號的原核表達載體pBV220質粒組裝成高效表達載體pBV-NK;(2)pBV-NK轉化大腸桿菌BL21-DE3,用溫度誘導重組納豆激酶基因的表達,表達產物以包涵體的形式存在于大腸桿菌BL21-DE3中;(3)通過發(fā)酵技術大規(guī)模培養(yǎng)大腸桿菌BL21-DE3,用溫度誘導重組納豆激酶基因表達,發(fā)酵參數為溫度28℃-40℃,溶氧量為50%-80%,PH6-8;(4)發(fā)酵后用高壓破碎細菌,離心收集破碎后的沉淀,將包涵體變性后,經凝膠過濾純化包涵體,包涵體復性后,經離子交換法純化重組納豆激酶,進行活性測定后,凍干成粉末保存。
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摘要
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納豆激酶是一種安全,高效的具有纖溶活性的酶制劑。目前已被深入研究,試圖作為口服溶栓劑予以開發(fā)應用。我們利用基因工程的方法,表達出具有纖溶活性的納豆激酶。重組產物和天然納豆激酶相比,具有良好的生物學活性。體內和體外實驗證明,納豆激酶具有良好的溶解血栓作用和促進內源性t-PA的產生,從而直接和間接的促進了溶栓作用。同時由于納豆激酶的安全性較高,沒有出現(xiàn)大出血等現(xiàn)象,易于口服治療。
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國際公布
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