| 公開(公告)號 | CN1188516C |
| 公開(公告)日 | 2005.02.09 |
| 申請(專利)號 | CN99119166.8 |
| 申請日期 | 1999.09.17 |
| 專利名稱 | 一種重組納豆激酶的編碼核苷酸序列及該酶的制備方法 |
| 主分類號 | C12N9/12 |
| 分類號 | C12N9/12;C12N15/70;C12N15/54;A61K38/45;A61P7/02 |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 常榮山 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 常榮山 |
| 地址 | 100080 北京市海淀區(qū)蘇州街18號長遠(yuǎn)天地A2座612室 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | |
| 代理人 | |
| 國省代碼 | 北京;11 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種制備重組納豆激酶的方法，包括納豆激酶基因克隆的構(gòu)建，在大腸桿菌中的表達(dá)，工程菌的發(fā)酵，表達(dá)產(chǎn)物重組納豆激酶的純化以及其生物活性的測定，其特征在于：(1)以枯草桿菌BacillussubtilisnottoAsl.1086菌體總DNA為模板，參考枯草桿菌中編碼納豆激酶EC.3.4.262的NAT基因序列設(shè)計(jì)引物，通過PCR方法直接擴(kuò)增納豆激酶基因，納豆激酶基因克隆進(jìn)pGEM-T載體后，經(jīng)序列分析證實(shí)，然后與含有cIta857基因，PrPL啟動子以及rrnB基因轉(zhuǎn)錄終止信號的原核表達(dá)載體pBV220質(zhì)粒組裝成高效表達(dá)載體pBV-NK；(2)pBV-NK轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21-DE3，用溫度誘導(dǎo)重組納豆激酶基因的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物以包涵體的形式存在于大腸桿菌BL21-DE3中；(3)通過發(fā)酵技術(shù)大規(guī)模培養(yǎng)大腸桿菌BL21-DE3，用溫度誘導(dǎo)重組納豆激酶基因表達(dá)，發(fā)酵參數(shù)為溫度28℃-40℃，溶氧量為50％-80％，PH6-8；(4)發(fā)酵后用高壓破碎細(xì)菌，離心收集破碎后的沉淀，將包涵體變性后，經(jīng)凝膠過濾純化包涵體，包涵體復(fù)性后，經(jīng)離子交換法純化重組納豆激酶，進(jìn)行活性測定后，凍干成粉末保存。 |
| 摘要 | 納豆激酶是一種安全，高效的具有纖溶活性的酶制劑。目前已被深入研究，試圖作為口服溶栓劑予以開發(fā)應(yīng)用。我們利用基因工程的方法，表達(dá)出具有纖溶活性的納豆激酶。重組產(chǎn)物和天然納豆激酶相比，具有良好的生物學(xué)活性。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證明，納豆激酶具有良好的溶解血栓作用和促進(jìn)內(nèi)源性t-PA的產(chǎn)生，從而直接和間接的促進(jìn)了溶栓作用。同時(shí)由于納豆激酶的安全性較高，沒有出現(xiàn)大出血等現(xiàn)象，易于口服治療。 |
| 國際公布 |
