| 公開(公告)號 | CN1683541A |
| 公開(公告)日 | 2005.10.19 |
| 申請(專利)號 | CN200510033569.9 |
| 申請日期 | 2005.03.17 |
| 專利名稱 | 人神經(jīng)營養(yǎng)素-3受體基因重組腺病毒構(gòu)建方法 |
| 主分類號 | C12N15/861 |
| 分類號 | C12N15/861;C12N15/12;C12Q1/68 |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院科技開發(fā)中心 |
| 發(fā)明(設(shè)計)人 | 曾園山;王俊梅 |
| 地址 | 510089廣東省廣州市中山二路74號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機構(gòu) | |
| 代理人 | |
| 國省代碼 | 廣東;44 |
| 主權(quán)項 | 一種人神經(jīng)營養(yǎng)素-3受體基因重組腺病毒構(gòu)建方法，其特征是，該方法包括(1)引物設(shè)計合成：從GenBank檢索人TrkC基因，針對基因全長設(shè)計兩端引物；(2)RT-PCR過程：取人腦mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)液5ml于1％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果；(3)克隆穿梭載體pShuttle-TrkC的構(gòu)建及鑒定：取RT-PCR反應(yīng)液，0.8％瓊脂糖凝膠電泳后，割膠純化目的基因(TrkC)片斷；連接純化TrkC基因和線性化的pShuttle，將產(chǎn)物擴增并提取質(zhì)粒，再測序鑒定質(zhì)粒中目的基因的序列；(4)重組腺病毒載體pAdeno-TrkC的構(gòu)建及鑒定：將pShuttle-TrkC與腺病毒骨架質(zhì)粒連接，常規(guī)方法轉(zhuǎn)化后進(jìn)行擴增并提取質(zhì)粒，并測序鑒定；(5)293細(xì)胞包裝：pAdeno-TrkC用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后第10天出現(xiàn)293細(xì)胞病變；收集病變細(xì)胞于-80℃/37℃反復(fù)凍融3次獲得病毒粗裂解液，并反復(fù)感染293細(xì)胞擴增病毒；(6)重組腺病毒的鑒定：①PCR鑒定：抽提病毒DNA為模板，以目的基因的上、下游引物進(jìn)行PCR鑒定；②RT-PCR鑒定：Ad-TrkC感染293細(xì)胞后收獲細(xì)胞，用Trizol試劑提取總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)液5ml于1％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果；③免疫細(xì)胞化學(xué)染色：將上述粗裂解的病毒液感染體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞球，用免疫細(xì)胞化學(xué)染色證實是否Ad-TrkC轉(zhuǎn)染；④Westernblot：粗裂解的Ad-TrkC病毒液感染神經(jīng)干細(xì)胞24小時后，裂解細(xì)胞做Westernblot證實是否有TrkC表達(dá)；(7)人神經(jīng)營養(yǎng)素-3受體基因重組腺病毒表達(dá)載體的生物學(xué)活性檢測：體外培養(yǎng)取自于綠色熒光小鼠海馬的神經(jīng)干細(xì)胞，觀察神經(jīng)營養(yǎng)素-3和神經(jīng)營養(yǎng)素-3受體對體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響。 |
| 摘要 | 本發(fā)明涉及一種用人神經(jīng)營養(yǎng)素-3受體基因(人TrkC基因)重組的腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。本發(fā)明的基本方案包括：引物設(shè)計合成，RT-PCR過程，克隆穿梭載體pShuttle-TrkC的構(gòu)建及鑒定，重組腺病毒載體pAdeno-TrkC的構(gòu)建及鑒定，293細(xì)胞包裝，重組腺病毒的鑒定，人神經(jīng)營養(yǎng)素-3受體基因重組腺病毒表達(dá)載體的生物學(xué)活性檢測等步驟。本發(fā)明的優(yōu)點在于選擇一種基因重組腺病毒表達(dá)載體來促進(jìn)受損傷的中樞神經(jīng)元存活及其軸突再生，以及促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞更多地分化為神經(jīng)元，替換受損傷的神經(jīng)元或死亡的神經(jīng)元。 |
| 國際公布 |
