| 公開(公告)號 | CN1311074C |
| 公開(公告)日 | 2007.04.18 |
| 申請(專利)號 | CN200410098027.5 |
| 申請日期 | 2004.12.03 |
| 專利名稱 | 重組表達(dá)的羧肽酶B及其純化 |
| 主分類號 | C12N9/00(2006.01)I |
| 分類號 | C12N9/00(2006.01)I;C12N9/48(2006.01)I;C12N15/52(2006.01)I;C12N15/57(2006.01)I;C12N15/63(2006.01)I;C12N11/00(2006.01)I;C12N15/81(2006.01)I;C12N1/19(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | 2003.12.5 EP 03028101.8 |
| 申請(專利權(quán))人 | 霍夫曼—拉羅奇有限公司 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | S·格拉瑟;F·蓋佩爾;T·柯施鮑姆;B·雷克塞爾;J·-P·塔爾霍菲;R·米勒;C·吉塞爾;H·�？耸┨┮�;E·沃爾夫 |
| 地址 | 瑞士巴塞爾 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 中國專利代理(香港)有限公司 |
| 代理人 | 張軼東;劉 玥 |
| 國省代碼 | 瑞士;CH |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種生產(chǎn)具有羧肽酶B活性的蛋白的方法，包括如下步驟：a)提供一種含有編碼由N-末端與組氨酸標(biāo)記融合的大鼠前羧肽酶B和信號肽構(gòu)成的前體蛋白的核苷酸序列的載體，由此在組氨酸標(biāo)記和信號肽之間或在組氨酸標(biāo)記和大鼠羧肽酶B之間任選地插入一種間隔序列；(b)采用該載體轉(zhuǎn)化一種微生物宿主有機(jī)體；(c)在含有營養(yǎng)物和碳源的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)該微生物宿主有機(jī)體，其中微生物宿主有機(jī)體表達(dá)前體蛋白并將組氨酸標(biāo)記的前羧肽酶B分泌至生長培養(yǎng)基中；(d)把步驟(c)的生長培養(yǎng)基中的分泌的組氨酸標(biāo)記的前羧肽酶B固定在能結(jié)合組氨酸標(biāo)記的顆粒狀的金屬螯合物親和基質(zhì)上，并沖洗顆粒狀的金屬螯合物親和基質(zhì)，從而將組氨酸標(biāo)記的前羧肽酶B固定；(e)在一種含有胰蛋白酶的緩沖液中溫育步驟(d)中的帶有固定化的組氨酸標(biāo)記的前羧肽酶B的顆粒狀的金屬螯合物親和基質(zhì)，由此通過蛋白水解方式酶切前羧肽酶B部分并將具有羧肽酶B活性的蛋白釋放到液相中，由此組氨酸標(biāo)記的前肽部分被固定；(f)從顆粒狀的金屬螯合物基質(zhì)中分離含有具有羧肽酶B活性的蛋白的液相，由此組氨酸標(biāo)記的前肽部分被固定；和(g)從步驟(f)的液相中純化具有羧肽酶B活性的蛋白。 |
| 摘要 | 本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)來源于非動物宿主有機(jī)體的，具有來自前羧肽酶B酶原的羧肽酶B活性的蛋白的制備方法。在非變性條件下，由酶原活化得到羧肽酶B。尤其是，該活化是在避免前肽與活化的羧肽酶B酶的不必要的非共價結(jié)合的條件下進(jìn)行的。 |
| 國際公布 |
