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1.2方法
1.2.1動(dòng)物分組及模型建立選健康活潑BALB/c 小鼠60只(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，雌雄各半，2 mo齡，體質(zhì)量(25±5)g. 自由飲食飲水，晝夜12 h交替光照，室溫25℃，濕度60% 左右. 每日21∶00 雌雄合籠，次日晨查精栓或陰道涂片，以精栓或陰道涂片查到精子做為受精標(biāo)志，記為E0d. 將體質(zhì)量相近的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為海洛因組和鹽水組. 從E0～E8 各組動(dòng)物自由進(jìn)食, E9～E18 d，鹽水組于21∶00在小鼠大腿外側(cè)皮下注射生理鹽水20 mL/（kg·d)，1/d，海洛因組組給予海洛因10 mg/（kg·d) 注射，1/d，將藥物溶于生理鹽水中，0.5 g/L. 子代分組同親代孕鼠.
1.2.2蛋白印跡實(shí)驗(yàn)仔鼠30 d齡時(shí)在各腦區(qū)取材，0.16 mol/L戊巴比妥鈉腹腔麻醉，速斷頭、開(kāi)顱、分離各腦區(qū)，即刻入液氮，凍存管分裝，-80℃貯存. 用時(shí)加入4℃胞質(zhì)蛋白提取液裂解，20∶1 加入蛋白酶抑制劑PMSF，高速分散器組織勻漿，冰浴1 h，12000 g 4℃離心10 min，沉淀加入4℃預(yù)冷核蛋白提取液，震蕩混勻，冰浴1 h，再12000 g 4℃離心30 min，取上清為核蛋白，其蛋白濃度經(jīng)考馬斯亮藍(lán)法定量，取上清加等體積2×SDS 樣品緩沖液，煮沸5 min 使蛋白變性. 取50 μg待測(cè)蛋白加入等體積2×上樣緩沖液煮沸5 min，行SDSPAGE 電泳，蛋白半干轉(zhuǎn)至PVDF膜. 100 V 恒壓轉(zhuǎn)移2 h后，將PVDF 膜在含5%脫脂奶粉的TBST中室溫下封閉1 h，與1∶1000一抗pp38 MAPK 兔多抗4℃孵育過(guò)夜，PBST 緩沖液洗膜3次，每次10 min；隨后加入羊抗兔 IgGHRP 37℃孵育1 h，洗膜3次，每次10 min. ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影，膠片曝光，UVP 凝膠成像系統(tǒng)掃描目的條帶，Labworks 軟件測(cè)量各陽(yáng)性條帶的光密度，將pp38 MAPK陽(yáng)性條帶與相應(yīng)的βactin 條帶吸光度比值作為其蛋白的相對(duì)表達(dá)量醫(yī).學(xué)全.在.線quanxiangyun.cn.
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)均采用SPSS12.0進(jìn)行處理，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析.
2結(jié)果
分析各組間相應(yīng)蛋白帶的平均吸光度值，以βactin作內(nèi)參蛋白，調(diào)整后進(jìn)行半定量分析. 與鹽水組相比，海洛因組動(dòng)物的前額葉皮層、海馬、伏核和杏仁核4個(gè)腦區(qū)組織的p38 MAPK磷酸化蛋白表達(dá)均明顯增加（P< 0.05，圖1，2).
3討論
MAPK信號(hào)系統(tǒng)作為真核細(xì)胞內(nèi)各種信息傳遞的最后通路和共同通路，能夠?qū)⒓?xì)胞外的各種刺激信息轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，是神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生一系列可塑性變化的分子基礎(chǔ). p38 MAPK 多見(jiàn)于促炎和促凋亡的途徑中，它在細(xì)胞分化、凋亡、遷移和增殖等基本生理過(guò)程中也發(fā)揮著不可忽視的作用［5］，許多細(xì)胞外刺激如應(yīng)激刺激、炎性細(xì)胞因子、細(xì)胞因子、脂多糖、生長(zhǎng)因子等通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活p38 MAPK，進(jìn)而磷酸化激活 MAPK APkinase2 等，并最終激活A(yù)TF2，Max 和MEF2 等轉(zhuǎn)錄因子而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)［6］，但其具體調(diào)制及與其他信號(hào)通路之間的關(guān)系尚未明了.
