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醫(yī)學論文范文:慢性高原病患者骨髓間充質(zhì)干細胞的體外擴增及鑒定

來源:本站原創(chuàng) 更新:2013-9-5 論文投稿平臺

1.2.4 MSC生長曲線測定:取P3代細胞制備單細胞懸液,調(diào)整細胞濃度至4×107/L,接種于24孔培養(yǎng)板(每孔200μL,37℃,體積分數(shù)為5% CO2的飽和濕度環(huán)境)培養(yǎng),每3 d換液1次。從第2天起每隔24 h計數(shù)3孔細胞數(shù),取其平均值作為當天細胞數(shù),以細胞數(shù)為縱坐標,天數(shù)(8d)為橫坐標,繪制細胞生長曲線。

1.2.5 MSC增殖能力鑒定:分離5×106個骨髓單個核細胞為起始在體外培養(yǎng)擴增MSCs,至P3、P4、P5代分別計數(shù)獲得的MSCs數(shù),將CMS組與對照組進行比較。

1.2.6 MSC傳代能力比較:分離5×106個骨髓單個核細胞為起始在體外培養(yǎng)擴增MSCs,進行傳代,記傳代次數(shù),將CMS組與對照組進行比較。

1.3 統(tǒng)計學處理方法

采用SPSS11.5統(tǒng)計分析軟件包進行數(shù)據(jù)分析計算。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示,兩組比較采用成組t檢驗,計數(shù)資料以率表示,兩組比較采用Fisher確切概率法檢驗;生長曲線結果采用重復測量方差分析。顯著性檢驗水準為α=0.05。

2 結果

2.1 骨髓MSC的生長形態(tài)觀察

倒置顯微鏡下觀察,可見接種后24~48 h少部分單個核細胞貼壁,貼壁細胞呈圓形,有小的胞質(zhì)突起。隨著培養(yǎng)時間延長,貼壁細胞開始分裂增殖,細胞呈現(xiàn)出成纖維細胞樣梭形外觀,胞質(zhì)豐富,核大居中,核仁明顯,1周后,細胞融合成單層,形態(tài)均一,梭形突起變長,呈長梭形。貼壁的MSC增殖迅速,培養(yǎng)到10~14 d時,呈現(xiàn)90%以上的細胞融合,排列有明顯方向性,細胞呈平行狀、旋渦狀、網(wǎng)狀或輻射狀生長。胰酶消化傳代及凍存復蘇后的細胞于24 h后完全貼壁,形態(tài)與原代相似。瑞士姬姆薩染色后,于光鏡下可見成纖維樣細胞形態(tài),胞漿呈淡藍色,可含空泡,可見數(shù)個深藍色的核仁,染色質(zhì)疏松,細胞呈平行排列生長或漩渦狀生長(見圖1)。CMS患者與對照組骨髓來源的MSC形態(tài)上差別不明顯,兩組MSC貼壁時間、集落大小無明顯差異,均在36~48 h時間內(nèi)貼壁。

圖1 慢性高原病骨髓間充質(zhì)干細胞形態(tài)(40×)

2.2 骨髓MSC表面標志分析醫(yī).學全.在.線網(wǎng)站quanxiangyun.cn

流式細胞儀檢測結果表明,CMS組與對照組骨髓MSC均不表達典型的造血細胞抗原分子,如CD34、CD45、HLADR、CD4、CD8、CD80等,而CD29、CD105、CD13表達為陽性,其表達量在兩組間無統(tǒng)計學差異。

2.3 CMS和對照組MSCs第三代(P3)生長曲線分析

CMS組骨髓MSCs在第4~5 d生長活躍,7 d后生長達平臺期,對照組培養(yǎng)6 d后生長達平臺期,結果見表1,圖2。

2.4 CMS和對照組MSCs體外擴增數(shù)量比較


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