 |
 |
慢性高原病(chronic mountain sickness，CMS)是高原低壓缺氧環(huán)境引起的一類高原特發(fā)性疾病，隨海拔增高其發(fā)病率呈增高趨勢(shì)。經(jīng)多年研究，對(duì)紅細(xì)胞增殖相關(guān)機(jī)制有了比較清楚的認(rèn)識(shí)，但對(duì)CMS尚存很多問(wèn)題有待進(jìn)一步闡明。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一群主要存在于骨髓中的非造血細(xì)胞，在體外不同的誘導(dǎo)條件下可分化為多種細(xì)胞。除具有多向分化潛能外，MSCs還表達(dá)多種造血細(xì)胞因子，又能分化為支持造血的骨髓基質(zhì)細(xì)胞，且與造血干細(xì)胞的歸巢密切相關(guān)，具有強(qiáng)大的支持造血及免疫調(diào)節(jié)等功能，具有廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值[1]。目前對(duì)CMS患者的MSC相關(guān)研究未見(jiàn)報(bào)道，故在此我們探討CMS患者骨髓MSCs的體外培養(yǎng)方法、生物功能及分子生物學(xué)特征。以期進(jìn)一步深化對(duì)CMS發(fā)病機(jī)制的研究。
1 資料與方法
1.1 病例資料
選擇15例就診于青海大學(xué)附屬醫(yī)院血液科的CMS患者(CMS組)。患者均為男性，年齡32～45歲，診斷符合第六屆國(guó)際高原大會(huì)2004年制訂的青海診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。15例對(duì)照組骨髓來(lái)源于血象和骨髓象正常的外傷性骨折患者的肋骨骨髓，選自青海大學(xué)附屬醫(yī)院骨科患者，本組患者均為男性，年齡24～48歲。兩組間性別、年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站quanxiangyun.cn。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 骨髓MSC的分離培養(yǎng)：無(wú)菌條件下以CMS患者髂后上嵴為穿刺部位，抽取骨髓液5 mL(以肝素鈉抗凝)，以等體積低糖DMEM稀釋;對(duì)照組在無(wú)菌條件下將肋骨髓腔以低糖DMEM沖洗后收集骨髓液。稀釋后的骨髓用密度為1.073 g/mL的Percoll分離液(Pharmacia公司)分離單個(gè)核細(xì)胞，DMEM洗滌2次，懸浮于含10%胎牛血清(FBS,Hyclon,美國(guó))的DMEM/F12培養(yǎng)液(Gibco公司)中，采用直接貼壁法，以含10%胎牛血清的DMEM/F12作為培養(yǎng)液，即hMSCs培養(yǎng)液(mesencult medium,stem cell Tech公司)。25 cm2塑料培養(yǎng)瓶(Costar)接種5×106個(gè)單個(gè)核細(xì)胞，置于37℃、5%CO2的飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。72 h后棄掉未貼壁細(xì)胞，更換培養(yǎng)液，以后每 3～4 d換液1次，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)90%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶/EDTA(Gibco公司)在37℃下消化貼壁細(xì)胞，收集細(xì)胞并懸浮于hMSCs培養(yǎng)液，按1∶3比例傳代培養(yǎng)，并標(biāo)記為P1;此后可依此傳代培養(yǎng)。傳代過(guò)程中每隔3 d全量換培養(yǎng)液，直至貼壁細(xì)胞彼此融合,鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶的底面;再重復(fù)以上的操作，將貼壁細(xì)胞消化分離，并按1∶2的比例進(jìn)行下一代的傳代接種培養(yǎng)，并標(biāo)記為P2。
1.2.2 MSC的形態(tài)學(xué)鑒定：每日在倒置顯微鏡下觀察貼壁細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、密度和生長(zhǎng)情況，取1、3、6代MSC，置于有玻片的3.5 cm直徑平皿中，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)1周，取出風(fēng)干，用瑞士姬姆薩染色后在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。
1.2.3 MSC表面標(biāo)志的測(cè)定：以0.25%胰蛋白酶消化收獲細(xì)胞，用PBS洗滌后計(jì)數(shù)，取2×106個(gè)細(xì)胞分別與 PE或 FITC標(biāo)記的鼠抗人CD29、CD34、CD45、CD13、CD14、CD3、CD4、CD8(BD公司)、CD105(Caltag公司)、HLADR和CD20單克隆抗體室溫避光反應(yīng)30 min，用PBS洗滌2次(1000 r/min,5min/次);加1%多聚甲醛1 mL，搖勻，4℃保存，1周內(nèi)用流式細(xì)胞儀(FACSCaliburBD公司，Cellquest軟件分析)確定所分離培養(yǎng)的MSCs的表型和純度。
