醫(yī)學(xué)論文范文:Toll樣受體2對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌IL8的影響

1 材料和方法

1.1 主要試劑

鼠抗人TLR��2 mAb(Santa Cruz公司)、IL��8 ELISA檢測(cè)試劑盒(R&D System公司)、Triton X-100(Bebco公司)、KC-SFM和DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司)、牛膠原酶(Roche公司)、分散酶Dispase Ⅰ(Roche公司)、鼠抗人CK(AE1/AE3)、即用型SP免疫組化試劑盒單克隆抗體、即用型DAB酶底物試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)。

1.2 角質(zhì)形成細(xì)胞的原代培養(yǎng)

人角質(zhì)形成細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定參考文獻(xiàn)[2]，具體過(guò)程如下：取兒童包皮環(huán)切術(shù)后的新鮮包皮，0.1%新潔爾滅溶液消毒，磷酸緩沖液(PBS)清洗后，剪去多余的皮下組織;標(biāo)本剪成皮片后浸入1.5 U/mL 的Dispase溶液中冷消化18～24 h，分離表皮和真皮，棄皮下組織和消化液;0.25%胰蛋白酶/EDTA消化液處理表皮，過(guò)濾殘?jiān)�，濾液離心后收集細(xì)胞;1%胎盼藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞活力并計(jì)數(shù);按4×104 /cm2 的細(xì)胞密度接種，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿皿底80%左右時(shí)，所得細(xì)胞直接用于實(shí)驗(yàn)或繼續(xù)傳代;培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)CK的免疫組化染色方法鑒定;所有試驗(yàn)取5代以內(nèi)的細(xì)胞。

1.3 白念珠菌(簡(jiǎn)稱白念)的培養(yǎng)

白念標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC 10231，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所真菌室友情提供)接種于37 ℃沙堡液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，試驗(yàn)用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期真菌;一個(gè)克隆形成單位定義為一個(gè)真菌細(xì)胞。

1.4 刺激實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)分為2組，A組：將細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，長(zhǎng)滿皿底80%左右時(shí)，直接加入白念活菌以及白念死菌(分別是細(xì)胞數(shù)的8倍)刺激角質(zhì)形成細(xì)胞。B組：每孔加入鼠抗TLR��2抗體20 μg/mL，孵育1 h，PBS洗滌，再分別加入上述刺激物，與角質(zhì)形成細(xì)胞孵育1、3、6、12、24 h時(shí)，取培養(yǎng)上清液，離心(5 000 r/min×5 min)，-20 ℃保存?zhèn)溆�。每個(gè)相同的刺激實(shí)驗(yàn)做3復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照(添加培養(yǎng)基)。按照IL��8 ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，BIO�睷AD酶標(biāo)儀測(cè)定樣品490 nm波長(zhǎng)的OD值。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)值以(x±s)表示，兩組樣本采用t檢驗(yàn)，三組及三組以上樣本之間的兩兩比較采用ANOVA檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

表1 中和前后實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組IL��8濃度比較注：與對(duì)照組比較，^P<0.05

如表1所示，白念活菌刺激角質(zhì)形成細(xì)胞后IL��8升高，3 h開始，達(dá)到(567.3±113.6) pg/mL，24 h為(1 079.9±236.6 )pg/mL，達(dá)到高峰，與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01);而白念死菌刺激后，IL��8僅有輕度升高，與對(duì)照組比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。用抗TLR��2抗體中和TLR��2作用后，白念死菌刺激組IL��8升高不明顯(P>0.05)，而白念珠菌活菌刺激組IL��8仍明顯升高(P<0.01)，但是TLR��2抗體中和前后比較，IL��8水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站quanxiangyun.cn。

3 討論

皮膚是機(jī)體防御外部環(huán)境中有害物質(zhì)入侵的第一道防線。作為表皮主要結(jié)構(gòu)的角質(zhì)形成細(xì)胞，除了構(gòu)筑防御病原微生物入侵的物理性屏障外，還通過(guò)分泌細(xì)胞因子、趨化因子和抗菌肽，向其他細(xì)胞傳遞信號(hào),引起中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的趨化;加速表皮細(xì)胞增殖，從而調(diào)節(jié)皮膚炎癥和免疫反應(yīng);并對(duì)入侵表皮的病原微生物有直接的殺傷作用，防止系統(tǒng)感染的出現(xiàn)。此外，紫外線、TL��1、TL��8、α�埠谒丶�(xì)胞刺激素(α�睲SH)可以增強(qiáng)角質(zhì)形成細(xì)胞的殺白念珠菌活性;前列腺素E2(PG E2)、血小板活化因子(platelet�瞐ctivating factor，PAF)也可能與殺傷作用有關(guān)[3]。

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