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先天性小耳畸形是由于胚胎時期第一鰓溝及其鄰近的第一、 二鰓弓的發(fā)育異常引起的一組頜面畸形，其病因尚不明確，環(huán)境和遺傳是重要發(fā)病因素，主要表現(xiàn)為外、中耳異常，傳導(dǎo)性或混合性耳聾，多伴有耳前凹、耳前贅或副耳。小耳畸形同時伴耳前凹、耳前贅等符合鰓-耳綜合征（Panchio-oto syndrome, BO)的診斷標(biāo)準(zhǔn)，BO 的個體具有與鰓-耳-腎綜合征（Panchio-oto-renal syndrome，BOR)相同的鰓耳畸形，只是缺少腎臟異常。因此，我們考慮先天性小耳畸形可能屬于 BO/BOR 疾病譜。本研究選擇的先天性小耳畸形患者，除不具有鰓裂瘺管的癥狀外，其余癥狀均符合BOS。人類中EYA1基因發(fā)生突變或表達(dá)異�？蓪�(dǎo)致BO/BOR。EYA1基因編碼的蛋白質(zhì)對鰓弓和耳部的正常發(fā)育至關(guān)重要，EYA1基因敲除小鼠具有外、中耳異常及傳導(dǎo)聾的癥狀。本實(shí)驗(yàn)對先天性小耳畸形伴耳前凹、耳前贅患者進(jìn)行EYA1基因突變檢測，但未發(fā)現(xiàn)EYA1基因突變位點(diǎn)，僅檢測到4 種單核苷酸多態(tài)，考慮EYA1基因突變可能不是中國人群先天小耳畸形的主要致病原因。
表觀遺傳是環(huán)境因素與細(xì)胞的遺傳物質(zhì)交互作用的結(jié)果， 表觀遺傳學(xué)的研究為揭示先天性小耳畸形發(fā)病機(jī)制提供了新的思路。表觀遺傳學(xué)是研究沒有DNA 序列變化的、可遺傳的表達(dá)改變, 其分子機(jī)制目前研究最深入的是甲基化形式的遺傳。 DNA甲基化便是其中一個為人所熟知的基因外遺傳信號，是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到胞嘧啶和鳥嘌呤二核苷酸(CpG)的胞嘧啶上。CpG 相對集中的區(qū)域稱為 CpG 島，CpG 島存在于組織特異基因或者管家基因中，大約50 %的人類基因中含有CpG 島，常位于基因上游調(diào)控區(qū)的啟動子區(qū)。DNA的甲基化狀態(tài)改變作為一個表觀的標(biāo)簽，易于受激素、飲食以及藥物等外界因素的可逆的修飾，標(biāo)示出該基因是沉默或表達(dá)。當(dāng)甲基化程度越高，基因就越沉默，反之亦然，即基因轉(zhuǎn)錄水平與其甲基化水平呈負(fù)相關(guān)。在腫瘤疾病中 DNA 甲基化改變表現(xiàn)為整個基因組 DNA 低甲基化、局部基因高甲基化。與腫瘤的過度增生相反，先天性小耳畸形屬發(fā)育不良性疾病，其DNA甲基化情況是否存在相應(yīng)的改變呢？我們選擇EYA1基因?yàn)楹蜻x基因，在先天性小耳畸形患者中檢測該基因啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)，結(jié)果顯示 EYA1 基因啟動子區(qū)域 CpGUnit_3 和 CpGUnit_5 甲基化程度顯著性低于正常對照，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示局部基因可能存在低甲基化狀態(tài)，整個基因組 DNA及其他候選基因甲基化情況還有待下一步研究。
目前使用的大多數(shù)甲基化檢測方法都是以亞硫酸氫鹽預(yù)處理法使胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏榛A(chǔ)的。預(yù)處理后，對于基因上核苷酸的變化檢測方法很多，但工作量巨大。以芯片技術(shù)為基礎(chǔ)的 MALDI-TOF質(zhì)譜分析技術(shù)具有高靈敏度和準(zhǔn)確度、分析速度快、測量范圍寬、分辨率強(qiáng)、小樣品等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了高通量的DNA甲基化檢測。我們應(yīng)用此技術(shù)對先天性小耳畸形患者 EYA1 基因啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示該區(qū)域 CpGUnit_3 和CpGUnit_5 甲基化程度顯著性低于正常對照，這表明 CpG 島中每個位點(diǎn)的甲基化率并不均一,可能在抑制基因轉(zhuǎn)錄上的作用也不同，這也同近期其他研究結(jié)果相吻合。此技術(shù)的缺點(diǎn)是要求檢測的擴(kuò)增片段為200~600bp大小，因而本研究中的Unit8和 Unit9因?yàn)榉肿恿刻【臀茨軝z測。CpGUnit_3 和CpGUnit_5 兩位點(diǎn)低甲基化改變， 我們推測其可能與先天性小耳畸形發(fā)病相關(guān)，可能的機(jī)制為：第一，EYA1 基因具有基因劑量效應(yīng)，達(dá)到一定閾值才能發(fā)揮正常功能醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站quanxiangyun.cn。這種閾值效應(yīng)可以解釋不同患者之間存在表型差異，即使在同一家系中也存在外顯不全和表現(xiàn)度變異。EYA1 基因低甲基化會導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄和翻譯過程的異常開放，干擾了相關(guān)發(fā)育基因的調(diào)控過程。第二，EYA1 基因低甲基化也可能引起患側(cè)組織染色體重構(gòu)，并進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞表型的變化，這也可能是許多BO未能檢測到 EYA1 基因突變，但觀測到染色體復(fù)雜重組的原因。其臨床意義尚需研究 EYA1 基因 CpGUnit_3 和 CpGUnit_5 兩位點(diǎn)低甲基化改變對基因表達(dá)及耳軟骨細(xì)胞生物學(xué)特性的影響進(jìn)一步予以證實(shí)。
