生物化學-實驗指導

來源：河北醫(yī)科大學精品課程網

生物化學:實驗指導:◎<福林—酚試劑法(Lowry 法)>◎<溫度、pH、激動劑和抑制劑對酶活性的影響>◎<基因組DNA的提取及鑒定>※quanxiangyun.cn<福林—酚試劑法(Lowry 法)>項目性質：研究性實驗學時：4分組人數：1人實驗原理:蛋白質中的酪氨酸等與酚試劑之磷鉬酸、磷鎢酸作用產生藍色化合物，其顏色深淺與蛋白質含量成正比。福林—酚法測定蛋白質的反應原理可分為兩個步驟：1.在堿性溶液中，蛋白質與銅離

◎<福林—酚試劑法(Lowry 法)>

◎<溫度、pH、激動劑和抑制劑對酶活性的影響>

◎<基因組DNA的提取及鑒定>

※quanxiangyun.cn<福林—酚試劑法(Lowry 法)>

項目性質：研究性

實驗學時：4

分組人數：1人

實驗原理:

蛋白質中的酪氨酸等與酚試劑之磷鉬酸、磷鎢酸作用產生藍色化合物，其顏色深淺與蛋白質含量成正比。

福林—酚法測定蛋白質的反應原理可分為兩個步驟：

1.在堿性溶液中，蛋白質與銅離子發(fā)生反應：

Cu⁺⁺ + 蛋白質→ Cu-蛋白質

2.Cu-蛋白質使試劑中的磷鎢酸—磷鉬酸還原成為藍色化合物，測定光吸收值就可以推算出蛋白質的含量。試劑中的碳酸鈉有緩沖作用，使溶液的pH值保持在10左右，顯色最深。福林—酚法的靈敏度高、蛋白質濃度測定范圍是25～250μg。

但此法實際上是蛋白質中酪氨酸和色氨酸等與試劑的反應，因此它受蛋白質氨基酸組成的影響，即不同蛋白質中氨基酸組成的不同會使顯色強度有所差別；此外，樣品中酚類及檸檬酸的干擾而使結果偏高。低濃度的尿素（約0.5%左右)、胍（0.5%醫(yī).學全在線quanxiangyun.cn左右)、硫酸鈉（1%)、硝酸鈉（1%)、三氯醋酸（0.5%)、乙醇（5%)、丙酮（0.5%)對顯色無影響，上述物質濃度高時必須做校正曲線。

操作步驟：

1.制作標準曲線

(1) 標準蛋白的選擇：最好選擇與待測樣品相同或組成類似的蛋白質作為標準蛋白溶液。

(2) 標準蛋白溶液的配制：將標準蛋白經凱氏定氮法準確測定其蛋白質含量，再用無離子水配制成1.0 mg/ml的儲存液。

(3) 按照表1 配成不同濃度的標準蛋白組，編上號碼，以第一管為空白管，在分光光度計上測定650nm處的光密度值。

表1 不同濃度的標準蛋白組配置

	1	2	3	4	5	6
標準蛋白溶液（0.1mg/ml)	0	0.2	0.4	0.6	0.8	1.0
生理鹽水（ml)	1.0	0.8	0.6	0.4	0.2	0
試劑 AB混合液（9：1)（ml)	1	1	1	1	1	1
混勻后置于50℃水浴10分鐘，冷卻
試劑C(ml)	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0
立即混勻，置50℃水浴保溫10分鐘，冷卻后比色。

(4) 以各標準溶液濃度為橫坐標，各管的光密度值為縱坐標作圖，作標準曲線。

標準曲線必須從零點出發(fā)，最好能成一直線，畫好后，注明所用儀器的型號及編號，所用波長及測定方法，名稱及制做日期。

2. 樣品蛋白的測定: 取試管2只，按表2 操作。

表2 樣品蛋白的測定

	測定管	空白管
稀釋待測樣品（ml)	1.0	-
生理鹽水（ml)	-	1.0
試劑 AB混合液（9：1)（ml)	1	1
混勻后置于50℃水浴10分鐘，冷卻
試劑C(ml)	3.0	3.0

立即混勻，置50℃水浴保溫10分鐘，冷卻后比色。

注意：各管加酚試劑必須快速，并立即搖勻，不應出現渾濁；測定蛋白質的濃度最好在15～110μg范圍。

試劑：

1.試劑A：2g酒石酸鉀鈉及100g Na₂CO₃溶于500ml 1.0mol/L NaOH 中，用水稀釋至1000ml。

2.試劑B：2g酒石酸鉀鈉及1g CuSO₄.5H₂O分別溶于少量水中,混合后加水至90ml再加1mol/L NaOH 10ml即成。

3.試劑C：市售的酚試劑按1：15稀釋，最后濃度為0.15-0.18mol/L(用標準NaOH 滴定)。

稱取Na₂WO₄.2H₂O及Na₂MoO₄.2H₂O 各25g溶于蒸餾水700ml中，加入85% H₃PO₄ 50ml、濃HCl 100ml，混勻后，置圓底燒瓶中加熱回流10小時，加入Li₂SO₄.H₂O 150g、蒸餾水50ml及溴水（Br₂)數滴，溶液變?yōu)榧t黃色，置通風櫥內加熱沸騰15分鐘蒸發(fā)Br₂，溶液呈透明的金黃色，冷卻后加蒸餾水定容至1000ml，過濾，置棕色瓶中保存，用標準NaOH標定其濃度，應用時用蒸餾水稀釋至濃度為0.15～0.18mol/L。

溶液中的硫酸鋰能防止磷鉬酸沉淀，溴可以氧化試劑中的還原物質，使其不致干擾顯色。4.標準蛋白溶液：稱量干燥的人血清白蛋白（BSA)或丙種球蛋白10mg，用生理鹽水配制成1mg/ml的標準蛋白溶液。

5.生理鹽水。

思考題：

1.Lowry 法測蛋白的反應原理及試用范圍？

2.測量蛋白的方法有幾種？各自的優(yōu)點是什么？

※<溫度、pH、激動劑和抑制劑對酶活性的影響>

實驗性質：驗證性

實驗學時：4

分組人數：1

（一)實驗原理

以唾液淀粉酶為例。

1. 溫度對酶活性的影響

（內容原理)

(C₆H₁₀O₅)_n (C₆H₁₀O₅)_n C₁₂H₂₂O₁₁

淀粉(膠體液乳狀光澤) 糊精麥芽糖

（1)與碘反應呈不同顏色，藍、紫、紅等，由淀粉斷裂而成大小不等情況而定。

（2)不與碘呈色，淀粉空間結構被完全破壞。

（3)與碘反應呈藍色（直鏈淀粉)。

（技術原理)

判斷間接判斷

碘是否水解；水解程度淀粉酶的活性大小

淀粉與碘反應后的顏色

2. pH對酶活性的影響唾液淀粉的最適pH為6.9。

用碘判斷底物淀粉消失的快慢，間接判斷酶活性高低。

3. 激動劑、抑制劑對酶活性的影響。

非必需激動劑：Cl^-離子

唾液淀粉酶

強烈抑制劑：Cu²⁺離子

（二)操作

1. 收集唾液

2ml唾液

用蒸餾水稀釋 2 ml煮沸待用

脫脂棉過濾， 2 ml（0℃-4℃水浴5分鐘待用) 5~10倍濾液其余37℃水浴保存

2. 溫度對酶活性的影響

分組：見表6-36。

表6-36 溫度對酶活性的影響加樣

步驟

管號

1 2 3 4 備注

第1步 20滴 20滴 20滴 20滴 10g/L淀粉

第2步 0℃-4℃水浴5min 37℃水浴5min 冷溫處理

第3步預冷唾液10滴預冷唾液10滴唾液10滴煮沸唾液10滴唾液

第4步攪勻0℃-4℃水浴5min 攪勻3 7℃水浴5min 冷溫處理

第5步 2滴 37℃水浴10min 2滴 2滴 2滴碘液

加唾液后應混勻各管，加碘液后搖勻，觀察并解釋結果。

3. pH對酶活性影響

（1)分組：見表6-37。

表6-37 pH對酶活性影響加樣

管號

加放試劑

1 2 3

磷酸鹽緩沖液 pH5.0 2 ml pH6.8 2 ml pH8.0 2 ml

10 g/L淀粉液 2 ml 2 ml 2 ml

稀釋唾液 10滴 10滴 10滴

（2)比色：取瓷比色盤一個，預先在各池中分別加滴稀碘液。

每隔1分鐘從第3管中吸取溶液1滴，加到已加有碘液的比色盤小池中，直至此管溶液與碘呈棕色向各試管加碘液2滴，搖勻觀察。

4. 激動劑、抑制劑對酶活性的影響

（1)分組（試管)：見表6-38。

表6-38 激動劑、抑制劑對酶活性的影響加樣

加入試劑（滴)	1	2	3	4	備注
10 g/L 淀粉	20	20	20	20	1管加激動劑
10 g/L NaCl	2				2管加抑制劑
10 g/L CuSO₄		2			3管為試驗對照
10 g/L Na₂SO₄			2		4管為系統(tǒng)空白對照
蒸餾水				2	均勻置于37℃水浴
稀釋唾液	10	10	10	10