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| 實驗二十五 酶促反應(yīng)動力學實驗的設(shè)計 |
【實驗目的】 酶促反應(yīng)動力學研究酶促反應(yīng)的速度以及影響酶促反應(yīng)速度的各種因素。影響酶促反應(yīng)的因素主要包括酶濃度、底物濃度、溫度、pH、抑制劑和激活劑。本實驗的目的即是通過設(shè)計一定的實驗方案，以分析研究各種因素對酶促反應(yīng)速度的影響。各實驗小組可在以下實驗項目中選擇一項，通過檢索參考文獻資料，組織課堂討論，設(shè)計完成實驗方案，并通過具體實驗操作以檢驗實驗方案的可行性和正確性。 （一)溫度對唾液淀粉酶活性的影響 【實驗原理】 酶作為生物催化劑與一般催化劑一樣呈現(xiàn)溫度效應(yīng)，酶促反應(yīng)開始時，反應(yīng)速度隨溫度升高而增快，達到最大反應(yīng)速度時的溫度稱為某種酶的最適溫度。由于絕大多數(shù)酶是有活性的蛋白質(zhì)，當達到最適溫度后，繼續(xù)升高溫度，引起蛋白質(zhì)變性，酶促反應(yīng)速度反而逐步下降，以至完全停止。 酶的最適溫度不是一個常數(shù)，它與作用時間長短有關(guān)。測定酶活性均在酶促反應(yīng)最適溫度下進行。常用恒溫水浴保持溫度恒定。大多數(shù)動物來源的酶最適溫度為37~40℃。 本設(shè)計性實驗以人唾液淀粉酶為例，觀察高溫（沸水浴)、最適溫度（37℃水浴)和低溫（冰水浴)環(huán)境對酶活性的影響，并根據(jù)底物即淀粉水解的快慢來判斷酶活性的高低。 淀粉經(jīng)淀粉酶催化水解為葡萄糖的不同階段，與碘試劑作用的顏色反應(yīng)如下：淀粉（藍色)→紫色糊精（紫色)→紅色糊精（紅色)→無色糊精（不顯色)→麥芽糖（不顯色)→葡萄糖（不顯色)。 【實驗試劑和器材】 1. 試劑 ⑴ 1/15 mol/LpH6.8磷酸鹽緩沖液（phosphate-bufferedsaline，PBS)：稱取NaH2PO4·2H2O10.4 g，溶于1000 mL蒸餾水中，即為1/15 mol/L NaH2PO4液。稱取Na2HPO4·12H2O23.88 g，溶于1000 mL蒸餾水中，即為1/15 mol/L Na2HPO4液。 取1/15quanxiangyun.cn/job/ mol/LNaH2PO4液51 mL，加1/15 mol/L Na2HPO4液49 mL，混勻，即為1/15 mol/L pH 6.8磷酸鹽緩沖液。 ⑵ 1%淀粉液。 ⑶ 0.3%稀碘液：溶解2 g KI于20 mL蒸餾水中，加入1g碘，于量筒中稀釋到300 mL。 ⑷ 0.9%NaCl。 2. 器材 ⑴ 試管及試管架。 ⑵ 滴管。 ⑶ 刻度吸量管。 ⑷ 恒溫水浴、冰水浴、沸水浴。 ⑸ 白瓷比色盤。 【設(shè)計提示】 1. 本實驗所用的酶是唾液淀粉酶，底物是淀粉。怎樣收集并稀釋人唾液淀粉酶？ 2. 淀粉水解后的產(chǎn)物是什么？怎樣才能判斷淀粉的水解程度？ 3. 將設(shè)計的不同溫度組、所用試劑、操作步驟等，以表格形式列出。 4. 討論并確定最佳實驗設(shè)計方案。 【實驗注意事項】 1. 在磷酸鹽緩沖液中，人唾液淀粉酶在pH6.8時具有最大活性。Cl-為其激活劑。 2. 觀察不同溫度對酶活性的影響時，溫度之間的差別應(yīng)較大。 （二)pH對唾液淀粉酶活性的影響 【實驗原理】 酶的催化活性與環(huán)境pH有密切關(guān)系，通常各種酶只在一定pH范圍內(nèi)才有活性，酶活性最高時的pH稱為酶的最適pH。高于或低于此pH時酶的活性逐漸降低。不同的酶最適pH也不同，如胃蛋白酶的最適pH為1.5~2.5，胰蛋白酶的最適pH為8.0。 酶的最適pH不是酶的特征性物理常數(shù)。對于同一種酶，其最適pH因緩沖液和底物的性質(zhì)不同而有差異。如人唾液淀粉酶最適pH為6.8，但在磷酸鹽緩沖液中，其最適pH為6.4~6.6，而在乙酸緩沖液中則為5.6。 本實驗以人唾液淀粉酶為例，觀察不同pH環(huán)境對酶活性的影響，并根據(jù)底物即淀粉水解的快慢來判斷酶活性的高低。 【實驗試劑和器材】 1. 試劑 ⑴ 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液：稱取Na2HPO4·2H2O35.61 g，溶于1000 mL蒸餾水中，即為0.2 mol/L Na2HPO4液。稱取檸檬酸（C6H8O7·2H2O)21.01 g，溶于1000 mL蒸餾水中，即為0.1 mol/L檸檬酸液。 取0.2 mol/L Na2HPO4液10.30 mL，加0.1 mol/L檸檬酸液9.70 mL，混勻，即為pH5.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液。 取0.2 mol/L Na2HPO4液11.37 mL，加0.1 mol/L檸檬酸液8.63 mL，混勻，即為pH5.5磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液。 取0.2 mol/L Na2HPO4液12.63 mL，加0.1 mol/L檸檬酸液7.37 mL，混勻，即為pH6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液。 取0.2 mol/L Na2HPO4液13.85 mL，加0.1 mol/L檸檬酸液6.15 mL，混勻，即為pH6.4磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液。 取0.2 mol/L 中國衛(wèi)生人才網(wǎng)Na2HPO4液15.45 mL，加0.1 mol/L檸檬酸液4.55 mL，混勻，即為pH6.8磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液。 取0.2 mol/L Na2HPO4液18.17 mL，加0.1 mol/L檸檬酸液1.83 mL，混勻，即為pH7.4磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液。 取0.2 mol/L Na2HPO4液19.45 mL，加0.1 mol/L檸檬酸液0.55 mL，混勻，即為pH8.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液。 ⑵ 1%淀粉液。 ⑶ 0.3%稀碘液：溶解2 g KI于20 mL蒸餾水中，加入1 g碘，于量筒中稀釋到300 mL。 ⑷ 0.9%NaCl。 2. 器材 ⑴ 試管及試管架。 ⑵ 滴管。 ⑶ 刻度吸量管。 ⑷ 恒溫水浴。 ⑸ 白瓷比色盤、秒表。 【設(shè)計提示】 1. 本實驗所用的酶是唾液淀粉酶，底物是淀粉。怎樣收集并稀釋人唾液淀粉酶？ 2. 淀粉水解后的產(chǎn)物是什么？怎樣才能判斷淀粉的水解程度？ 3. 將設(shè)計的不同pH組、所用試劑、操作步驟等，以表格形式列出。 4. 討論并確定最佳實驗設(shè)計方案。 【實驗注意事項】 1. 在磷酸鹽緩沖液中，人唾液淀粉酶在pH6.8時具有最大活性。Cl-為其激活劑。 2. 觀察不同pH對酶活性的影響時，pH之間的差別應(yīng)較大。
（三)琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制 【實驗原理】 在化學結(jié)構(gòu)上與底物類似的抑制劑，能與底物競爭和酶分子的活性中心結(jié)合，抑制酶的活性。抑制的程度隨抑制劑與底物兩者濃度的對比而定。如果底物濃度不變，酶活性的抑制程度隨抑制劑的濃度增加而增加。反之，如果抑制劑的濃度不變，則酶活性隨底物濃度的增加而逐漸恢復，這種類型的抑制稱為競爭性抑制。 本設(shè)計性實驗的目的是觀察丙二酸對琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制。琥珀酸脫氫酶的活性，在隔絕空氣的條件下，可從加入的甲烯藍（methelene blue)的褪色情況來判斷。
【實驗試劑和器材】 1. 試劑 ⑴ 1/15 mol/LpH 7.4磷酸鹽緩沖液：稱取9.078 g KH2PO4溶于蒸餾水中，1000 mL容量瓶中稀釋到刻度，為1/15 mol/L KH2PO4溶液。稱取23.87 g Na2HPO4·12H2O溶于蒸餾水中，于1000 mL容量瓶中稀釋到刻度，為1/15 mol/L Na2HPO4溶液。 取1/15 mol/L KH2PO4溶液175 mL，1/15 mol/L Na2HPO4溶液825 mL，混合，即為1/15 mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液。 ⑵ 0.2mol/L琥珀酸。 ⑶ 0.02mol/L琥珀酸。 ⑷ 0.2mol/L丙二酸。 ⑸ 0.02mol/L丙二酸。 ⑹ 0.02%甲烯藍（methelene blue)。 2. 器材 ⑴ 試管及試管架。 ⑵ 滴管、漏斗、紗布。 ⑶ 刻度吸量管。 ⑷ 高速組織搗碎機。 ⑸ 燒杯、研缽。 ⑹ 恒溫水浴箱。 【設(shè)計提示】 1. 本實驗以大鼠骨骼肌為實驗材料以提取琥珀酸脫氫酶，底物是琥珀酸，競爭性抑制劑是丙二酸。 2. 怎樣才能判斷琥珀酸脫氫酶活性的高低？ 3. 將設(shè)計的不同濃度比組、所用試劑、操作步驟等，以表格形式列出。 4. 討論并確定最佳實驗設(shè)計方案。 【實驗注意事項】 1. 琥珀酸脫氫酶在pH7.4的磷酸鹽緩沖系統(tǒng)中有較高活性。 2. 設(shè)計時應(yīng)使琥珀酸與丙二酸的濃度比有較大的差異。
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