藥物分析-授課教案:第十章　甾體激素類藥物分析

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

第一節(jié) 基本結構與分類

一、結構特點

天然和人工合成品的甾體激素，均具有環(huán)戊烷駢多氫菲母核。

結構特點：A環(huán)，多為脂環(huán)，且C₄/C₅間有雙鍵，并與C₃酮基共軛，稱為α，β-不飽和酮，標記為Δ⁴-3-酮；少數(shù)為苯環(huán)；C₃，可能有酮基或羥基；C₁₀、C₁₃，多數(shù)為角甲基，少數(shù)C₁₀無角甲基；C₁₁，可能有酮基或羥基；C₁₇，可能有羥基、酮基、甲酮基、α-醇酮基、甲基、乙炔基等；人工合成的甾體激素，有些在C₆或C₉上引入鹵素，C₁₆上引入甲基、羥基，以及具有C₁/C₂雙鍵等；有些取代基是α型（用虛線表示)，有些是β型（用實線表示)。

二、分類

腎上腺皮質(zhì)激素和性激素兩大類。性激素又分雄性激素及蛋白同化激素、孕激素、雌激素等。

(一)腎上腺皮質(zhì)激素

天然和人工合成的腎上腺皮質(zhì)激素（簡稱皮質(zhì)激素)均可視為皮質(zhì)酮的衍生物，如可的松、波尼松、地塞米松等。

C₂₁-羥基所形成的酯類（常見為醋酸、磷酸、戊酸、己酸等的酯)，肌注時延長作用時間。有時為了增加其水溶性，常作成鈉鹽，如BP（1993)、JP（13)及USP（23)收載的氫化可的松磷酸鈉、氫化可的松琥珀酸鈉等。

結構特點：有21個C原子；A環(huán)，具有Δ⁴-3-酮； C₁₇，有α-醇酮基，并多數(shù)為α-羥基；C₁₀、C₁₃，有角甲基；C₁₁，有羥基或酮基；其它，有些皮質(zhì)激素具有Δ¹，6α、9α鹵素，16α羥基，6α、12α、16α、16β甲基等。

（二)雄性激素及蛋白同化激素

臨床常用睪酮的衍生物，如甲睪酮、丙酸睪酮、十一酸睪酮等；蛋白同化激素有苯丙酸諾龍。

結構特點：雄性激素母核具有19個C原子；蛋白同化激素母核具有18個C原子（C₁₀上無角甲基)；A環(huán)，具有Δ⁴-3-酮；C₁₇，無側鏈，多數(shù)是一個β-羥基，有些是它形成的酯，有些具有α-甲基。

講授結合多媒體教學

復習舊課（3min)

作業(yè)解析(5min)

引入新課(2min)

5min

10min

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

也稱黃體酮或孕酮，典型藥物為黃體酮。

中國藥典（1995版)收載有：黃體酮、醋酸甲羥孕酮、己酸羥孕酮、醋酸甲地孕酮原料及制劑；醋酸氯地孕酮原料等。

結構的特點：有21個C原子；A環(huán)，具有Δ⁴-3-酮； C₁₇，有甲酮基，有些具有α-羥基，與醋酸、己酸等形成酯（如：醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、己酸羥孕酮等)；其它，有些具有Δ⁶，6β-甲基、6α-甲基、6β-氯。

（四)雌激素

又稱卵泡激素。收載有：雌二醇、炔雌醚原料，苯甲酸雌二醇、戊酸雌二醇、炔雌醇原料及制劑等。

結構特點：具有18個C原子； A環(huán)，為苯環(huán)；C₃有酚羥基，有些形成酯或醚；C₁₀，無角甲基；C₁₇，有β-羥基或酮基，有些羥基形成了酯，有些具有乙炔基。

除此以外，中國藥典95版收載口服避孕藥物：炔諾酮、炔諾孕酮、炔孕酮等，具有上述結quanxiangyun.cn/shouyi/構的特點，多數(shù)在A環(huán)上具有Δ⁴-3-酮，于黃體酮和睪酮一致；有的在C₁₇上具有β-羥基、α-乙炔基或甲酮基；有的在C₁₀上無角甲基，與雌激素相同。

   第二節(jié) 鑒別實驗

母核和結構的呈色反應、沉淀反應、制備衍生物測定熔點、水解產(chǎn)物的反應、薄層色譜法、紫外分光光度法、紅外分光光度法等都是鑒別甾體激素藥物常用的方法。  

一、呈色反應

（一)與強酸的呈色反應

硫酸、磷酸、高氯酸、鹽酸等呈色，硫酸為主�？赡軝C制為濃硫酸與甾體的酮基質(zhì)子化反應，形成正碳離子，然后與HSO₄^-作用。

列表

特點：操作簡便，反應靈敏，通過形成的顏色或熒光的不同而互相區(qū)別，但操作條件不易掌握。  

15min

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

1.C₁₇-α-醇酮基 有還原性，能與氧化劑四氮唑鹽反應顯色。（可做薄層的顯色劑)；

2.酮基 C₃-、C₂₀-能與2，4-二硝基苯肼、異煙肼、硫酸苯肼等羰基試劑反應呈色。

3.甲酮基以及活潑亞甲基 能與亞硝鐵氰化鈉、間二硝基酚、芳香醛類反應呈色。

4.有機氟 經(jīng)氧瓶燃燒后生成無機氟化物，在與茜素藍及硝酸亞鈰呈色；5.酚羥基 能與重氮磺酸反應生成紅色偶氮染料。

二、沉淀反應

1.與斐林試劑 C17-α-醇酮基具有還原性，生成橙紅色氧化亞銅沉淀。

2.氨基硝酸銀 C17-α-醇酮基，黑色金屬銀沉淀

3.硝酸銀 炔雌醇、炔諾酮，白色沉淀。

4.硝酸-硝酸銀 有機氯破壞在酸性條件下，白色沉淀。  

三、制備衍生物測定其熔點

生成酯、肟、縮氨基脲，或利用醇制堿液水解甾體酯類生成相應的母體，然后測定其熔點。

1.   酯的生成

2.   酮肟的生成

3.   縮氨基脲的生成

4.   酯的水解

四、水解產(chǎn)物的反應

醋酸、戊酸和己酸酯水解后鑒別酸。

五、紫外分光光度法

C=C-C=O和C=C-C=C共軛系統(tǒng)，可用規(guī)定波長和吸收度比值法鑒別。

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

結構復雜，各國藥典幾乎均采用紅外分光光度法鑒別，中國藥典95版。36種原料，其中33種采用該法。 

七、薄層色譜法

簡便、快速、分離效能高等特點。

方法：

供試品溶液和對照品溶液的制備 供試品通常需做前處理（如有機溶劑提取)，消除注射液、片劑及軟膏劑等輔料的干擾。將處理好的供試品和對照品用規(guī)定溶劑配成一定濃度的溶液備用。

展開與檢出 將供試品與對照品在同一塊薄層板上分別點樣，用規(guī)定的展開劑展開，取出晾干，用規(guī)定的顯色劑顯色，立即檢視。供試品溶液所顯斑點與對照品溶液所顯斑點的Rf值相同。

部分甾體類藥物的薄層色譜條件歸納見表

示例

八、高效液相色譜法

保留時間一致鑒別。

討論：IR解釋。

課間休息十分鐘

第三節(jié) 特殊雜質(zhì)檢查

多由結構改造來，可能帶來原料、中間體、異構體、降解產(chǎn)物以及試劑溶劑等，是一重要項目。此外，有些甾體藥物還規(guī)定其他檢查項目。

一、游離磷酸

示例 中國藥典95版收載地塞米松磷酸鈉的檢查，方法為：

稱取供試品20mg，置25ml量瓶中，加水15ml溶解；另取標準磷酸鹽溶液[精密稱取經(jīng)105℃干燥2h的磷酸二氫鉀0.35g，置1000ml量瓶中，加硫酸溶液（3→10)10ml與水適量使溶解，并稀釋至刻度，搖勻；臨用時再稀釋10倍]4.0ml，置另一25ml量瓶中，加水11ml；各精密加鉬酸銨硫酸試液2.5ml與1-氨基-2萘酚-4-磺酸溶液（另取無水亞硫酸鈉5g，亞硫酸氫鈉94.3G與1-氨基-萘酚-4-磺酸0.7g，充分混合，臨用時取此混合物1.5g加水10ml使溶解，必要時過濾)1ml，加水至刻度，

10min

20min

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

原理：酸性條件下，磷酸與鉬酸作用生成磷鉬酸銨，再經(jīng)還原形成磷鉬酸藍（鉬藍)，在740nm波長處有最大吸收。

二、甲醇和丙酮

示例 地塞米松磷酸鈉方法：

精密量取甲醇10μl（相當于7.9mg)與丙酮100μl（相當于79mg)，置100ml量瓶中，精密加0.1%（ml/ml)正丙醇（內(nèi)標物質(zhì))溶液20ml，加水稀釋至刻度，搖勻，作為對照液；另取本品月約0.16g，精密稱定，置10ml量瓶中，精密加入上述內(nèi)標溶液2ml，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品。取上述溶液，照氣相色譜法，用高分子多孔小球色譜柱（按正丙醇計算的理論板數(shù)應大于700)，在柱溫150℃測定。含丙酮不得過5.0%（g/g)，并不得出現(xiàn)甲醇峰。

本品在生產(chǎn)工藝中使用大量甲醇和丙酮，因此要檢查。甲醇的檢測限為3.1ng。

三、雌酮

炔雌酮中雌酮檢查方法如下：

取本品5mg溶于0.5ml乙醇，加間二硝基苯0.05g，再加新配制的稀氫氧化鉀-乙醇液0.5ml，在暗處放置1h后，再加乙醇10ml時，溶液呈現(xiàn)的顏色不得比下面的對照液更深。對照液：不加本品同樣方法制成。

原理：Zimmermann反應，羰基的鄰位具有活潑亞甲基的化合物，在堿性的氫氧化鉀乙醇溶液中，與間二硝基苯反應呈紅~藍色。雌酮是17-酮甾類，因此根據(jù)該反應生成紫紅色化合物，必須使用高純度的間二硝基苯，否則呈褐色而難于判定。

四、硒

五、其他甾體

甾體激素藥物多由甾體母體或結構類似的其他甾體激素制備而來，也具有一定的藥理作用而又互相不相同，使其他甾體或有關物質(zhì)的限度檢查顯得非常必要，成為甾體激素藥物純度檢查的一個重要項目。TLC和HPLC為各國近版藥典采用36中原料中34中采用薄層色譜法檢查；10中原料已采用HPLC法。

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

1.薄層板：大多采用硅膠G板，少數(shù)采用硅膠GF₂₅₄或硅膠HF₂₅₄。

2.供試液和對照液的制備：取一定量供試品和對照品，分別用溶劑（如氯仿-甲醇或甲醇或氯仿或丙酮)配成一定濃度的溶液。

3.展開劑系統(tǒng)：各種不同比例的二氯甲烷-乙醚-甲醇-水混合溶劑用得最多；還有苯、無水乙醇、二氯甲烷-甲醇-水、氯仿-甲醇、二氯甲烷-醋酸甲酯-水、苯-丙酮等混合溶劑。

4.顯色劑：堿性四氮唑藍試液；硫酸-乙醇（2：8或1：1或3：7)；20%硫酸；10%磷鉬酸-乙醇液。

5.檢測法：用堿性四氮唑藍試液作顯色劑時，以展開劑展開后，晾干，在105℃干燥10min，放冷，噴以堿性四氮唑藍試液，立即檢視；用硫酸-乙醇顯色劑時，以展開劑展開后，晾干，噴以硫酸-乙醇，在120℃或100℃加熱5min，放冷置紫外光燈（365nm)下檢視；用20%硫酸顯色時，用展開劑展開后，晾干，噴以20%硫酸顯色，在105℃加熱10min后檢視；用10%磷鉬酸-乙醇液時，以展開劑展開后，晾干，噴以10%磷鉬酸-乙醇液，在100℃加熱10~15min，在日光下檢視；某些甾體激素藥物，如醋酸去氧皮質(zhì)酮、地塞米松磷酸鈉、倍他米松磷酸鈉等采用硅膠GF₂₅₄薄層板，用展開劑展開后，晾干，直接在紫外燈（254nm)下檢視。

判定法：按各藥品項下規(guī)定得雜質(zhì)斑點的數(shù)目和顏色的要求進行判定。

示例

（二)高效液相色譜法 色譜條件如下：

1.色譜填充柱：十八烷基硅烷鍵和硅膠。

2.流動相：各種不同比例的甲醇-水混合溶劑。

3.檢測器：紫外（214nm，254nm，281nm，230nm，288nm)。

4.供試液和對照液的制備：將供試品用甲醇溶解配制成高（1)、低（2)二種濃度的溶液。

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

即按各藥品項下規(guī)定的雜質(zhì)峰的數(shù)目和面積的要求進行判定。

示例：

第四節(jié) 含量測定

容量法、比色法、紫外分光光度法、熒光法、氣相色譜法、高效液相色譜法等，本章重點討論四氮唑比色法、異煙肼比色法、Kober反應比色法、紫外分光光度法、高效液相色譜法等。

一、四氮唑比色法

（一)四氮唑的種類 兩種

（二)反應原理

皮質(zhì)激素C₁₇-α-醇酮基具有還原性，在強堿性溶液中能將四氮唑鹽定量地還原為有色甲簪（formazan)。

（三)測定方法 USP（23)采用藍四氮唑；中國藥典（1995版)和BP（1993)采用紅四氮唑。

中國藥典收載地醋酸潑尼松龍軟膏的含量測定方法如下：

1.對照品溶液制備：精密稱取醋酸潑尼松龍對照品20mg，置100ml量瓶中，加無水乙醇振搖使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.供試品溶液的制備：精密稱取本品4g（約相當于醋酸潑尼松龍20mg)，置燒杯中，加無水乙醇約30ml，置水浴上加熱，充分攪拌，使醋酸潑尼松龍溶解，在置冰浴中放冷后，濾過，濾液濾入100ml量瓶中，同法提取3次，濾液并入量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

3.測定法：精密量取對照品溶液及供試品溶液各1ml，分別置干燥具塞試管中，各精密加無水乙醇9ml與氯化三苯四氮唑試液2ml，搖勻，再精密加氫氧化四甲基銨試液1ml，搖勻，在25℃暗處放置40~45min，照分光光度法，在485nm的波長處分別測定吸收度，計算，即得。  

20min

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

1.基團的影響：C₁₁-酮基反應速度快于C₁₁-羥基甾醇；C₂₁-羥基酯化后較其母體羥基的反應速度慢；當酯化了的基團為三甲基醋酸酯、磷酸酯或琥珀酸酯時，反應更慢。

2.溶劑和水分的影響：5%以下不影響，超過大時，呈色速度減慢，采用無醛溶劑。

3.堿的種類和加入順序的影響：氫氧化四甲基銨較好，常用。但有研究表明，皮質(zhì)激素和氫氧化四甲基銨長時間（24h)接觸后，皮質(zhì)激素有部分分解，因此，先加四氮唑鹽溶液再加堿液好。

4.空氣中氧及光線的影響：反應及其產(chǎn)物對光敏感，因此必須用避光容器并置于暗處顯色，同時達到最大顯色時間后，立即測定吸收度。藍四氮唑?qū)�對空氣中氧敏感，明顯影響顏色強度和穩(wěn)定性，因此BP規(guī)定在加入試劑后要往容器中充氮氣。

5.溫度與時間影響：顯色速度隨溫度增高而加快。一般以室溫或30℃恒溫條件下顯色，易得重線性較好的結果。BP（1993)多數(shù)在30℃反應1h，中國藥典多數(shù)在25℃暗處反應40~45min。 

二、異煙肼比色法

（一)原理  甾體激素C₃-酮基及某些其他位置上的酮基都能在酸性條件下與羰基試劑異煙肼縮合形成黃色異煙腙，在一定波長下具有最大吸收。

某些具有兩個酮基的甾體激素可行成雙腙，如黃體酮、可的松氫化可的松等。

（二)測定方法 醋酸地塞米松軟膏含量測定方法如下：

1.對照品溶液制備：精密稱取醋酸地塞米松對照品25mg，置100ml量瓶中，加無水乙醇振搖使溶解，并稀釋至刻度，搖勻。精密 量取5ml，用無水乙醇稀釋至50ml，搖勻，即得。

2.供試品溶液的制備：精密稱取本品適量（約相當于醋酸潑尼松龍2.5mg)，置燒杯中，加無水乙醇約25ml，置水浴上加熱，充分攪拌，使醋酸地塞米松溶解，在置冰浴中放冷后，濾過，濾液濾入100ml量瓶中，同法提取3次，濾液并入量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

（三)討論

1.溶劑選擇：無水乙醇和甲醇好，其他受溶解度影響不能采用甲醇穩(wěn)定性較好，呈色強度較高。

2.酸的種類和濃度以及異煙肼的濃度：酸與異煙肼試劑的摩爾比為2：1時可獲得最大吸收度。

3.水分、溫度、光線和氧的影響：水增高吸收度降低，縮合水解；溫度升高，反應加速。在實驗條件下，光與氧不影響反應。

4.反應的專屬性：Δ⁴-3-酮基的甾體激素在室溫不到1h即可定量地與酸性異煙肼反應；其他長時間放置或加熱后方可反應完全，因此在反應條件下，本法對Δ⁴-3-酮基甾體具有一定的專屬性。

  三、KOBER反應比色法

指雌激素與硫酸-乙醇共熱呈色，用水或稀硫酸稀釋后重新加熱發(fā)生顏色改變，并在515nm附近有最大吸收。

反應分兩步：與硫酸-乙醇共熱產(chǎn)生黃色，在465nm處有最大吸收；加水或稀硫酸稀釋重新加熱顯桃紅色，在515nm處有最大吸收。

可能原理：通過去羥基、重排及甲基由C₁₃移到C₁₇而形成產(chǎn)物（1)；然后被硫酸氧化形成具有較長共扼雙鍵發(fā)色團的產(chǎn)物（3)及進一步生成具有吸收光譜紅移發(fā)色團的產(chǎn)物（4)。

鐵-酚試劑（iron-phenol reagent)文獻上也稱鐵-柯柏試劑（iron-Kober reagent)。為硫酸亞鐵銨加水溶解后，加硫酸及過氧化氫，再與苯酚混合制成。改進法，優(yōu)點：鐵加速速度和強度，加速黃色轉變?yōu)榧t色，也增加穩(wěn)定性；酚加入，可以消除反應中產(chǎn)生的熒光并加速紅色的形成。  

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

1.對照品溶液制備：精密稱取炔雌醇對照品25mg，置100ml量瓶中，加無水乙醇振搖使溶解，并稀釋至刻度，搖勻；精密 量取2ml，用無水乙醇稀釋至50ml，搖勻，即得（10μg/ml)。

2.供試品溶液的制備：取本品10片或20片，置具塞試管中，加水10ml，振搖使崩散、置水浴上加熱至半透明，放冷，精密加氯仿10ml，密塞，振搖20min，靜置分層后，吸取上層水溶液，加無水硫酸鈉0.5g，振搖脫水后，經(jīng)干燥濾紙濾過，棄取初濾液，精密量取續(xù)濾液2ml，置水浴中蒸干后，低溫干燥，放冷，精密加無水乙醇使溶解成每1ml中約含10μg的溶液，即得。

3.測定法：精密量取對照品溶液及供試品溶液各1ml，分別置試管中，在冰浴中冷卻，各精密滴加硫酸-乙醇（4：1)4ml，搖勻顯色后，在530nm的波長處分別測定吸收度，計算，即得。

四、紫外分光光度法

許多甾體激素分子中存在Δ⁴-3-酮基（C=C-C=O)和苯環(huán)（C=C-C=C)共扼系統(tǒng)，因而在紫外光區(qū)有特征吸收，240nm附近有最大吸收，有苯環(huán)的在280nm附近有最大吸收，可用于含量測定。

95版中國藥典中25中甾體激素原料及片劑用該法測定含量，占本類藥物分析的28%，僅次于HPLC。

紫外分光光度法準確、簡便，被廣泛用于原料和制劑的分析，但在片劑分析時需要預處理排除干擾。

醋酸可的松片的測定方法：

取本品20片，精密稱定，研細，精密稱取適量（相當于醋酸可的松20mg)，置100ml量瓶中，加無水乙醇75ml，時時振搖約1h，使醋酸可的松溶解，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，用干燥濾紙濾過，精密量取續(xù)濾液5ml，置另一100ml量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，照分光光度法，在238nm的波長處測定吸收度，按醋酸可的松的吸收系數(shù)（E^1%_1cm)為390計算，即得。  

基本內(nèi)容

注解（進展、輔助

手段和時間分配)

特點：樣品用量少、靈敏度高、分離效能好、快速等優(yōu)點，各國藥典多采用。中國藥典89中甾體激素原料和制劑中，有43種采用HPLC法（內(nèi)標法多)，占該類藥物分析方法的48%，居首位。反相分配色譜最廣。固定相常用十八烷基硅烷鍵和硅膠；流動相甲醇-水-乙醚、乙腈-水-乙丙醇、甲醇-四氫呋喃-水、甲醇-乙腈-水等的混合液。為了提高分離效率、獲得滿意的峰形，有時在流動相中加入醋酸緩沖液或磷酸緩沖液調(diào)節(jié)流動相的pH值，紫外直接檢測。

醋酸潑尼松龍的測定方法如下：

1.色譜條件與系統(tǒng)適應性試驗 用十八烷基硅烷鍵和硅膠為填充柱，甲醇-水（70：30)為流動相，檢測波長為240nm。理論塔板數(shù)按醋酸潑尼松龍計算應不低于3000，醋酸潑尼松龍和內(nèi)標物質(zhì)峰的分離度應符合要求。

2.內(nèi)標溶液的制備 取醋酸氟氫松，加甲醇制成每1ml中含0.50mg的溶液，即得。

3.測定法 取醋酸潑尼松龍對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并定量稀釋制成每1ml中約含0.50mg的溶液；精密量取該溶液與內(nèi)標溶液各5ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；取5μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取本品適量，同法測定，按內(nèi)標法以峰面積計算，即得。

總結：對本人所講的各章節(jié)進行簡單總結。   

問題討論(5min)

作業(yè)和習題布置(2min)

歸納總結(3min)

小 結

本次課主要講授了①甾體激素藥物的化學結構差異與分析方法的關系(掌握)；②“其它甾體”、特殊雜質(zhì)檢查方法的基本原理(掌握)；③四氮唑比色法、異煙肼法的基本原理和方法(掌握)；④Kober反應比色法，紫外分光光度法，HPLC法(了解)。

復習思考題

或

作 業(yè) 題

1、甾體激素可分為具體的哪幾類，各自的結構特點是什么？

2、甾體激素可用哪些方法鑒別？

3、甾體激素類藥物特殊雜質(zhì)有哪些，怎樣檢查？

4、常用的甾體激素含量測定方法有哪些？

教 學 效 果

與 分 析

多媒體教學和板書相結合，并結合一定的實例，加深學生對知識點的認識和了解。特別是通過問題討論，讓大家對所學知識進行回顧、討論，建立一個互動的教學氛圍。效果較好。