�。�3)免疫染色
�、偾衅ê�50～70nm)貼在金網(wǎng)或覆有碳膜的鎳網(wǎng)上。所有下列步驟在室溫、濕盒內(nèi)進(jìn)行。所有溶液需經(jīng)微孔濾紙（0.25～0.45μm)濾過。
②正常羊血清30min。
③第一抗血清（PBS稀釋)，37℃2h。
�、芸捎脽ǎɑ蛩芰蠅貒娤捶�)，以鑷夾鎳網(wǎng)在第一燒杯中洗蕩30min，然后在第二燒杯中洗蕩1h 。
⑤正常羊血清30min。
⑥第二抗血清（膠金標(biāo)記抗體)以正常羊血清稀釋為1：1，以鎳網(wǎng)置于血清滴上孵育1h。
�、邲_洗如④。
�、喔灿�2%OSO4水溶液上，30min。
⑨沖洗如④。
⑩干燥后在電鏡下觀察。
（4)Lowicryl K4M快速包埋染色法（Altman等1984)
�、侔駝┑呐渲疲簡� 體13g
交聯(lián)劑2g
引發(fā)劑75mg
②生物樣品處理：除了聚合這一步驟外，下列所有步驟都在20℃進(jìn)行。
1)組織用3%戊二醛—3%多聚甲醛磷酸緩沖液，pH7.4,在20℃固定1～2h。用磷酸緩沖液清洗后進(jìn)行脫水。
2)脫水：在50%、75%和90%的雙甲基甲酰胺（Dimethylformamde,DMF)內(nèi)系列脫水，每步10min。
3)浸透：Lowicryl K4M:DMF=1:2 10min
Lowicryl K4M:DMF=1:1 15min
100% Lowicryl K4M 20min
100% Lowicryl K4M 25min
4)包埋與聚合：組織移入裝滿K4M的膠囊中，以紫外線燈照射聚合（紫外線燈條件同上)，燈和組織距離10cm,4℃照射45min，組織塊在室溫進(jìn)行超薄切片（切片時(shí)水槽內(nèi)水面應(yīng)略低以防浸濕組織塊的切面)。
5)以覆有碳膜的鎳網(wǎng)撈取切片。
6)免疫染色。
整個(gè)包埋時(shí)間僅需4～5h。
Lowicryls 應(yīng)保存在暗處，-4℃，該物質(zhì)有刺激性，在配制時(shí)應(yīng)戴手套，以免觸及皮膚。在通風(fēng)櫥內(nèi)操作，以免蒸氣刺激眼睛。如觸及皮膚和眼睛，應(yīng)立即以水沖洗局部，氧化重金屬如KmnO4能與包埋劑作用而影響染色效果，以不用為佳。
2．LR White 和Lr gold 是一種混合的丙烯酸單體的透明樹脂，具有極低的粘度（8cps)和較強(qiáng)的嗜水性，因此有較強(qiáng)的穿透性，有利于抗體（或抗原)和免疫化學(xué)物質(zhì)穿過LR樹脂，達(dá)到組織結(jié)合部位。在免疫細(xì)胞化學(xué)的光鏡（半薄切片)和電鏡水平應(yīng)用都具有良好效果。標(biāo)本脫水至70%乙醇即可，能較好地保持抗原性。Lr white和Lr gold在國外提供廠家有 Poly－sciences INC等，Lr gold是一種光引發(fā)低發(fā)低溫聚合的包埋劑，對于免疫細(xì)胞化學(xué)特別適用，能最大限度地保持組織的抗原與抗體活性，其最佳光聚合溫度在-25℃，在聚合后呈現(xiàn)金黃色，因而得名。Lr white可在熱和冷兩種情況下聚合，熱聚合在60℃，24h，冷聚合在-25℃，需加加速劑（accelerator)調(diào)整配制比例。生物樣品處理與免疫染色等同常規(guī)樹脂切片。
3．GMA 是乙二醇甲基丙烯酸酯（Glycol Methacrylate 即2—hydroxyethyl methacrylate, HEMA)的縮寫。遠(yuǎn)在60年代，電鏡工作者就試圖將其作為生物包埋劑應(yīng)用于光鏡和電鏡。GMA作為電鏡包埋劑的優(yōu)點(diǎn)是電子密度大，影像反差好。但存在三個(gè)主要缺點(diǎn)：一是包埋聚合后的組織塊很脆，不易修整和切片。二是聚合過程中易造成組織損傷如人為的細(xì)胞器腫脹。三是缺乏穩(wěn)定性，不能承受電子束的轟擊，包埋劑遇熱升華，造成組織塌陷變形。故后來為環(huán)氧樹脂所取代。聚合后的環(huán)氧樹脂有良好的塑料穩(wěn)定性，能承受電子束的轟擊不變形，而且影像反差好，分辨率高，但其半薄切片染色不夠滿意始終是個(gè)有待解決的問題。而GMA包埋切片的染色效果明顯優(yōu)于環(huán)氧樹脂。于是電鏡工作者如Leduc和Bernhard（1986)嘗試以增加一定比例的增塑劑如甲基丙烯酸酯和少量水外，并加入適量的增塑劑如聚乙二醇400（PEG400)以改變其硬度，加入適量的聞聯(lián)劑乙烯二甲基丙烯酸酯（ethylene dimethacrylate)以增強(qiáng)其抗電子束轟擊的穩(wěn)定性。為避免聚合時(shí)過快，產(chǎn)生高溫，損傷組織結(jié)構(gòu)，選用低溫型引發(fā)劑—過氧化苯甲酰（Benzoyl Peroxide)，溫度范圍-10℃～-30℃。經(jīng)過不斷的配制改進(jìn)，現(xiàn)GMA已廣泛應(yīng)用于半薄切片（1～3μm)的光鏡觀察，特別是組織化學(xué)方面的研究和電鏡水平的免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。現(xiàn)將GMA包埋劑的配制、生物樣品處理和電鏡水平的免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法簡介如下：
（1)GMA單體溶液在出廠時(shí)都加有氫醌類穩(wěn)定劑，用前須以每25ml單體溶液加一匙活性碳，在振蕩器上振蕩5min，過濾以除去氫酯，以免影響聚合。
（2)包埋劑的配制：
a. 100% GMA 66.5ml
N—甲基丙烯酸丁酯 28.5ml
5%乙烯二甲丙烯酸酯 5.0ml
1.5 %過氧體苯甲�！ �1.0g
1.0%PEG 400 1.0ml
b.A液：
GMA單體液 90ml
PEG 400 5～9.4ml
過氧化苯甲�！ �0.2～0.69g
攪拌溶解后置棕色瓶內(nèi)； 4℃保存。
B液：
PEG 400 20ml
二甲基苯胺 1ml
應(yīng)用時(shí)A：B按10：1比例充分混合（張承志等1986)。
�。�3)生物樣品處理：組織固定可用PLP液或1%戊二醛溶液（磷酸緩沖液配制，pH7.4)。經(jīng)系列酒精脫水至新鮮的GMA單體溶液中浸24h。以上步驟可在室溫或4℃進(jìn)行。
（4)包埋聚合：組織移入盛潢包埋液的膠囊內(nèi)，先放在真空泵內(nèi)以去除包埋液中的氣泡，然后在4℃，以紫外線燈（波長360nm)在距膠囊底部10～20cm處進(jìn)行照射12～16h，以手指捏膠囊試其硬度可知聚合是否完成。在聚合完成后，將膠囊丟入熱水中以去除膠囊外殼。
�。�5)切片貼在鎳網(wǎng)上，按PAg技術(shù)進(jìn)行包埋染色，其區(qū)別于EPON包埋劑者，在于GMA包埋切片染色所需時(shí)間較短，在第一抗血清中，GMA室溫只需孵育1h，而EPON包埋切片需16～20h；在第二抗血清，即Pag 復(fù)合物中室溫30min，而EPON包埋切片需1h。鈾、鉛雙染后，電鏡觀察。
低溫包埋劑常用于鐵蛋白或膠體金免疫電鏡技術(shù)的包埋后染色。能檢出應(yīng)用環(huán)氧樹脂包埋難以檢出的多種抗原。
四、對照試驗(yàn)
為確定方法的特異性，免疫電鏡技術(shù)也需進(jìn)行對照試驗(yàn)（同第一章 )。
總之，不論哪一種免疫電鏡技術(shù)都面臨微細(xì)結(jié)構(gòu)的保存和組織中抗原活性的保存這一對矛盾，如戊二醛、鋨酸等固定液有利于微細(xì)結(jié)構(gòu)的保存，但對抗原活性有影響，而H2O2能增加樹脂穿透性，但對微細(xì)結(jié)構(gòu)有損傷，能使反應(yīng)部位產(chǎn)生孔洞。在生物樣品處理過程中，應(yīng)同時(shí)注意到這兩個(gè)方面。其次，每次免疫染色中的清洗工作應(yīng)注意徹底，否則非特異性產(chǎn)物和其他污染物會影響特異性反應(yīng)產(chǎn)物的顯示和觀察。根據(jù)作者經(jīng)驗(yàn)，以塑料水壺加錐形噴水頭噴洗，與鎳網(wǎng)面成平行方向，即順網(wǎng)面噴洗，較之目前通用的杯水洗滌法易于達(dá)到清潔目的。沖洗的殘留水滴以濾紙吸干時(shí)，應(yīng)注意不要觸及載網(wǎng)本身�？蓪V紙剪成三角形，以尖端接觸水滴，即可達(dá)到吸干水份的目的，整個(gè)過程中，必須應(yīng)用雙蒸水，容器應(yīng)專用。
