四、石蠟包埋組織DNA分析的方法學(xué)
由于DNA提取方法的改善和DNA質(zhì)量的提高，幾乎所有基因分析的技術(shù)均可用于石蠟包埋組織，但目前分子病理學(xué)研究的常用方法是點(diǎn)雜交、Southern印跡雜交和多聚酶鏈反應(yīng)（PCR)。
1．點(diǎn)雜交 鑒于包埋組織DNA有一定程度的降解，因而點(diǎn)雜交被認(rèn)為是一種簡(jiǎn)便、快速和實(shí)用的方法，特別適用于較大樣本的篩選。Dyall – smith等（1988)采用未經(jīng)抽提的蛋白酶消化產(chǎn)物直接點(diǎn)膜，進(jìn)行點(diǎn)雜交分析，在3周內(nèi)對(duì)200多病例進(jìn)行篩選，對(duì)陽(yáng)性病例和很難解釋的弱陽(yáng)性斑點(diǎn)，再進(jìn)行原位雜交等方法作進(jìn)一步證實(shí)。
2．Southern印跡雜交Southern印跡雜交是經(jīng)典的基因分析技術(shù)，已被廣泛地用于基因突變，擴(kuò)增、重排和丟失等許多方面的研究。石蠟包埋組織的Southern印跡雜交分析有以下幾個(gè)方面值得注意：
�。�1)當(dāng)所分析的酶切片段長(zhǎng)為300～500bp時(shí)，包埋組織DNA雜交信號(hào)強(qiáng)度只有相同量標(biāo)準(zhǔn)DNA的10%～85%。信號(hào)強(qiáng)度與原始DNA大小呈正相關(guān)，最小片段DNA產(chǎn)生最弱的信號(hào)。
�。�2)包埋組織DNA所致的非特異性背景雜交比標(biāo)準(zhǔn)DNA為明顯。這種背景雜交的產(chǎn)生可能是由于不包含到分析基因中兩個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的小片段DNA存在。
�。�3)由于背景雜交明顯使得信號(hào)模糊，信/噪比縮小。根據(jù)Goelz的經(jīng)驗(yàn)，約有25%石蠟包埋組織不適于作Southern印跡雜交。
�。�4)某些限制性酶切片段的電泳速度比標(biāo)準(zhǔn)DNA稍遲緩�？赡艿脑蚴荄NA直接或間接的化學(xué)改變使某些限制性酶切位點(diǎn)失活和/或單鏈DNA存在。
（5)由于小片段DNA的存在，故用作雜交分析的DNA量應(yīng)適當(dāng)增加，以增強(qiáng)雜交信號(hào)。
3．PCR分析PCR技術(shù)是近年來(lái)分子生物學(xué)技術(shù)的典范，已被廣泛地用于分子病理學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。此技術(shù)不但特異性好和敏感性高，而且簡(jiǎn)便、快速、模板DNA要求不高，特別適于石蠟包埋DNA的分析。
用于PCR擴(kuò)增的DNA提取比較簡(jiǎn)單，既使少量DNA樣品亦能產(chǎn)生大量特異性DNA拷貝。已被成功地用于各代木乃伊DNA的分析，小至1mm2的HE染色切片提取的DNA亦可獲得滿意的擴(kuò)增，并可用于診斷。但是，為了提高PCR的敏感性和可重復(fù)性，模板DNA應(yīng)盡可能地純化，除去提取物中某些抑制PCR反應(yīng)的成份。
此外，切片過(guò)程中要注意防止污染，以免出現(xiàn)假陽(yáng)性。
最近，Davis等（1993)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行單鏈構(gòu)型多態(tài)性（SSCP)分析，可以提高PCR敏感性5倍以上。SSCP分析是應(yīng)用單鏈DNA在非變性聚丙酰胺凝膠上電泳，根據(jù)序列的不同所產(chǎn)生的構(gòu)型差異來(lái)分析PCr 產(chǎn)物。此分析能檢測(cè)出小到一個(gè)堿基的差異，因而可被廣泛地用于研究點(diǎn)突變和基因多態(tài)性。
此外，在包埋組織的DNA提取中往往發(fā)現(xiàn)有RNA的存在。這些未加任何保護(hù)而免受降解的RNA，不可能是完整的序列。然而，此發(fā)現(xiàn)提示用福爾馬林固定的組織亦可作為Northern印跡雜交分析的可能材料來(lái)源。
五、分子病理學(xué)研究中的應(yīng)用
1．基因重排分析與淋巴瘤的診斷分子生物學(xué)技術(shù)在腫瘤診斷中的應(yīng)用，目前僅限于淋巴瘤/白血病。淋巴瘤以具有特異性抗原受體基因重排的單一性細(xì)胞增殖為特征。因此，克隆性免疫球蛋白（Ig)和T-細(xì)胞受體（TCR)基因重排的檢出可作為淋巴瘤診斷的重要指標(biāo)，這在國(guó)外許多實(shí)驗(yàn)室已成為常規(guī)診斷技術(shù)。
Southern印跡雜交和PCR都已被成功地用于基因重排分析。此技術(shù)在下列病變的診斷和鑒別診斷中特別有意義：①惡性淋巴瘤與反應(yīng)性淋巴組織增生的鑒別。后者為多克隆性細(xì)胞增生，不能檢出或擴(kuò)增出克隆性基因重排序列；②T和B細(xì)胞性腫瘤的區(qū)分：PCRβ基因重排支持T細(xì)胞源性，而Ig重鏈基因則為B細(xì)胞源性。然而，一部分病例顯示Ig和TCR基因雙重排。在這種情況下，要結(jié)合其他基因分析。若同時(shí)伴有Ig輕鏈（K或人)基因重排則支持B細(xì)胞腫瘤；同時(shí)伴有TCRr或TCRs基因重排則為T細(xì)胞腫瘤。另外，也可結(jié)合免疫分型。雙基因重排的腫瘤往往一種基因?yàn)椴煌耆嘏拧⒉话橛邢鄳?yīng)的抗原受體表達(dá)，故免疫表型上往往是單一的。③T細(xì)胞性淋巴瘤的診斷，T細(xì)胞腫瘤形態(tài)變化多端、免疫表型上無(wú)克隆性標(biāo)記，故對(duì)此類淋巴瘤均有必要進(jìn)行基因分型。④T細(xì)胞優(yōu)勢(shì)性B細(xì)胞淋巴瘤。這種腫瘤在形態(tài)和免疫表型上很難建立診斷。⑤殘留病變監(jiān)測(cè)和復(fù)發(fā)的早期診斷。此技術(shù)還可用于識(shí)別骨髓的累及、治療或骨髓移植后殘余病變的檢測(cè)，以及形態(tài)學(xué)上不能察覺(jué)的早期復(fù)發(fā)的診斷。
某些淋巴瘤/白血病所伴有的特異性染色體易位是另一種類型的基因重排標(biāo)記。例如濾泡型淋巴瘤中常出現(xiàn)的t（14：18)易位，Burkitt氏淋巴瘤的t（8：14)、t（8：2)和t（8：22)易位，以及慢�；蚣绷馨籽≈谐Ｒ�(jiàn)的t（9：33)易位。因上述基因重排在淋巴瘤中出現(xiàn)頻率不高，故診斷應(yīng)用價(jià)值不大。
2．癌基因與抗癌基因的研究分子生物學(xué)在腫瘤病理學(xué)中另一熱點(diǎn)是癌基因和抗癌基因的研究。自從1981年Weinberg 等首先報(bào)道人癌基因分離成功以來(lái)，至今已有50多種癌基因被發(fā)現(xiàn)，這些基因普遍存在于各種生物細(xì)胞中，對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化起著重要作用。在正常情況下，其表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控；病理狀態(tài)下，癌基因活化，表達(dá)失控，使細(xì)胞原有的正常生物學(xué)性狀發(fā)生改變，從而導(dǎo)致細(xì)胞癌變。據(jù)報(bào)道，癌基因的結(jié)構(gòu)和功能改變見(jiàn)于造血系統(tǒng)、乳腺、粘膜鱗狀上皮、前列腺、肺、腎、消化道、膀胱、卵巢、消化腺、神經(jīng)系統(tǒng)和軟組織等腫瘤。
另一類基因稱抗癌基因或抑癌基因，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的有p53、Rb、DCC、WT1和NF1等。其蛋白產(chǎn)物的功能是阻滯癌基因所編碼多肽的活性。因此，如果抗癌基因發(fā)生突變或功能喪失，異常的癌基因產(chǎn)物表達(dá)失控，而誘發(fā)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤。此現(xiàn)象為見(jiàn)于視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、子宮內(nèi)膜、結(jié)腸、食管等各部位的腫瘤。
目前，對(duì)人類腫瘤中癌基因和抗癌基因的檢測(cè)，已經(jīng)在腫瘤的分類、發(fā)病機(jī)理、腫瘤生物學(xué)行為和預(yù)后的關(guān)系等方面與腫瘤臨床密切結(jié)合起來(lái)，并正在逐漸地應(yīng)用于腫瘤的診斷、鑒別診斷和治療。
（1)癌變機(jī)理的研究：癌基因活化和抗癌基因失活在人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。已有大量證據(jù)表明，至少需要兩種以上的癌基因活化的協(xié)同作用才能使正常細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。目前研究發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)腫瘤有一種以上的癌基因過(guò)度表達(dá)，一種癌基因?qū)Π屑?xì)胞的永生化起重要作用，而另一種則促進(jìn)細(xì)胞的永生化。
�。�2)腫瘤生物學(xué)待業(yè)和預(yù)后的研究：某些癌基因突變及其產(chǎn)物的過(guò)度表達(dá)與癌細(xì)胞的分化和惡性程度有關(guān)。目前研究最多的是c –erbB –2與乳腺癌的關(guān)系。許良中等（1992)發(fā)現(xiàn)，浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中c – erbB –2陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)67%以上，單純癌陽(yáng)性率為26.5%，而全部乳癌良性病變皆陰性。我們的研究發(fā)現(xiàn)，c –erbB –2 過(guò)度表達(dá)的乳腺癌預(yù)后不良，Schimmelpenning等（1992)也報(bào)告伴有c –erbB –2 擴(kuò)增的導(dǎo)管內(nèi)癌易于發(fā)生周圍浸潤(rùn)。此外，ras P21在乳腺癌中的表達(dá)也有上述趨勢(shì)。
�。�3)輔助診斷和鑒別診斷：bc1-2基因已被用于濾泡型淋巴瘤與反應(yīng)性濾泡增生的鑒別診斷，前者陽(yáng)性表達(dá)率在80%以上，而后者幾乎為陰性；ras癌基因突變或過(guò)度表達(dá)有助于甲狀腺乳頭狀癌、乳腺導(dǎo)管癌、結(jié)腸腺癌等腫瘤的診斷；小細(xì)胞肺癌常伴有n –myc突變。
�。�4)癌細(xì)胞的組織發(fā)生：paget 氏病可分乳腺外（EPD)和乳腺內(nèi)（MPD)兩種。有關(guān)paget細(xì)胞的起源問(wèn)題仍有爭(zhēng)議。許良中（1993)觀察了c –erbB –2和p53在77例EPD和10例MPD中的表達(dá)，認(rèn)為MPD中的paget細(xì)胞是來(lái)源于腺癌細(xì)胞而不是表皮的角質(zhì)層細(xì)胞。EPP中的paget細(xì)胞也來(lái)源于腺癌細(xì)胞，但這種腺癌細(xì)胞與MPD中的腺癌細(xì)胞不同，因?yàn)閮烧呋虮磉_(dá)不同。
3．遺傳病的基因診斷遺傳病的回顧性家族調(diào)查，可通過(guò)石蠟包埋組織完成。Mueller等描述1例懷疑囊性纖維化（CF)的死嬰，石蠟包埋組織是唯一的材料來(lái)源。應(yīng)用CF基因標(biāo)記引物，對(duì)患兒和其父母的DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用相應(yīng)內(nèi)切酶消化并檢測(cè)限制性片段多態(tài)性。結(jié)果顯示父母和患兒在同一位點(diǎn)上有意義，表明患兒遺傳有突變型CF基因，最后證實(shí)了CF的診斷。
另一種常見(jiàn)的遺傳病–肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（DMD)，是由Dystrophin基因的DNA序列畸變引起。Forstboefel等用該基因的已知編碼DNA序列，從一死嬰尸檢組織中得到的DNA進(jìn)行選擇性PCR擴(kuò)增。結(jié)果發(fā)現(xiàn)DMD基因的一關(guān)鍵部分缺失，進(jìn)而證實(shí)了DMD的診斷。同樣可通過(guò)親代DNA分析，區(qū)分遺傳性或散發(fā)性缺失。
4．病理微生物的檢測(cè)核酸雜交和PCR技術(shù)對(duì)病原微生物的檢測(cè)亦具有獨(dú)到之處，除其特異性和敏感性極高外，還可適用于石蠟切片等多種材料，且可避免因培養(yǎng)造成的病原擴(kuò)散。特別是一些原位雜交和PCR診斷性試劑盒的問(wèn)世，使此項(xiàng)檢測(cè)更加簡(jiǎn)便易行。因此，分子生物學(xué)將是傳染病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的發(fā)展方向。這方面的應(yīng)用已有很多報(bào)道，本節(jié) 不再贅述。
5．組織來(lái)源的鑒定PCR可用于選擇性擴(kuò)增一部分HLa –DQa 基因，這部分是人類基因組中高度多肽性的位點(diǎn)。DNA序列微小的個(gè)體差異，可被特異性cDNA探針區(qū)分。此基因在人群中的正常變異是有圖譜的，故可將其用作“基因指紋”來(lái)驗(yàn)證組織來(lái)源。在日常工作中偶爾遇到標(biāo)本的標(biāo)記錯(cuò)誤，當(dāng)觀察組織切片，發(fā)現(xiàn)與臨床資料不匹配時(shí)才被發(fā)現(xiàn)。Shibata等通過(guò)分析石蠟標(biāo)本DNA中HLa –DQa位點(diǎn)解決了這一難題。另一高度多肽性的基因-低密度脂蛋白受體基因，亦可同樣用于標(biāo)本的鑒定。
Dubeau等發(fā)現(xiàn)提取DNA的甲基化類型是恒定的，包埋組織仍保留其原有的特異性甲基化特征，籍此可有助于識(shí)別某些腫瘤的起源組織。
綜上所述，石蠟包埋組織DNA的提取擴(kuò)展了分子生物學(xué)技術(shù)在臨床上的應(yīng)用范圍。雖然現(xiàn)在回顧性DNA分析僅用于確定少數(shù)特異性診斷，但隨著越來(lái)越多的感染性病原基因、特異性腫瘤基因和遺傳病基因的識(shí)別和克隆，相信不遠(yuǎn)的將來(lái)基因診斷的應(yīng)用范圍會(huì)進(jìn)一步拓寬，分子雜交等基因分析技術(shù)將會(huì)在病理學(xué)診斷和研究中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。
（張建中)
