此種ISHH與ICC聯(lián)合法穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)周期短，藍(lán)色與棕色反差強(qiáng)，是目前較好的ISHH與ICC結(jié)合法。詳細(xì)程序如下：
�。�1)將切片漂浮于能經(jīng)受高壓滅菌的器皿中。0.1mol/l PBS pH7.2沖洗3×5min。
（2)0.1mol/L甘氨酸PBS沖洗5min。
�。�3)0.4% Triton X-100 PBS 15min。
�。�4)1μg./ml蛋白酶K（0.1mol/l Tris –HCl pH8.0, 50mmol/L EDTA 配)，37℃保溫30min。
�。�5)4%多聚甲醛PBs 5min。
�。�6)PBS沖洗2×min。
�。�7)0.25%乙酸酐（0.1mol/L三乙醇胺配)10min。
�。�8)2×SSC沖洗10min。
（9)將切片用滅菌吸水紙吸干，然后入雜交液。核酸探針濃度為0.25～0.5μg./ml。每一正常成年大鼠腦冠狀切片15μl雜交液足夠。43℃保溫12～16h。
�。�10)4×SSc 37℃沖洗30min。
�。�11)2×SSC（含RNasea 20μg/ml)37℃保溫30min。
�。�12)1×SSC和0.5×SSc 37℃分別沖洗30min。
�。�13)0.05mol/l PBS沖洗3×5min。
�。�14)0.5%H2O2 PBS室溫20min。
（15)0.05mol/l PBS 沖洗2×5min。
�。�16)堿性磷酸酶標(biāo)記抗地高辛抗體（Fab)與抗蛋白或多肽等抗體混合液，前者一般1：1000稀釋，后者則因抗體而異。稀釋液：1%BSA，0.4%Triton X-100 ,0.05mol/L PBS pH7.2，4℃孵育24h。
�。�17)0.05mol/l PBS沖洗4×5min。
�。�18)二抗（1：100～1：200)37℃保溫1h。
�。�19)0.05mol/l PBS沖洗3×5min。
�。�20)PAP（1：200～1：400)37℃保溫1h。
�。�21)0.05mol/l PBS沖洗3×5min。
�。�22)DAB顯色液（0.05%DAB + 0.03% H2O2,0.05mol/L PBS pH7.2配)顯色5～10min。
�。�23)0.05mol/l PBS沖洗3×5min。
�。�24)TSM，沖洗2×5min（TSM1：0.1mol/l Tris – HCl pH8.0,0.1mol/L NaCl,0.01mol/L MgCl2).
（25)硝基四氮唑藍(lán)（400μg/ml)和5-溴-4-3-吲哚磷酸（200μg/ml)混合液（TSM2配顯色混合液)顯色1～3h，避光。
�。�26)20mmol/l EDTA終止顯色。
�。�27)將切片貼于涂有鉻礬明膠的載片上，空氣干燥。
�。�28)梯度酒精脫水，透明、封片。
結(jié)果：ISHH陽性細(xì)胞的胞質(zhì)呈紫藍(lán)色，胞核不著色，示該細(xì)胞含XmRNA。ICC陽性細(xì)胞的胞質(zhì)呈棕色，胞核不著色示該細(xì)胞含X多肽。雙標(biāo)記細(xì)胞的胞質(zhì)為藍(lán)棕混合色，示多肽與mR－NA共存于該細(xì)胞內(nèi)。
