四、原蟲低溫保存
用液氮保存原蟲，具有保持原蟲生物學特性，且保存時間較長的優(yōu)點。現(xiàn)僅介紹瘧原蟲、弓形蟲、人毛滴蟲及陰道毛滴蟲的低溫保存方法。
1.凍存方法
惡性瘧原蟲：將從受染者采得的抗凝含蟲血或體外培養(yǎng)的培養(yǎng)物，經(jīng)1500rpm離心10分鐘，加入與沉積細胞等量的24%二甲基亞砜（DMSO)生理鹽水溶液（0.9%生理鹽水或5%葡萄糖生理鹽水76ml中加入DMSO24ml)保護劑，充分混勻后在室溫中放置30分鐘，按0.5～1.0ml分裝入無菌安瓿（或塑料管)內(nèi)，封口（或蓋嚴)后將之放入標明批號的紗布袋中，裝于液氮罐的提筒內(nèi)，先置于液氮罐的頸部，該處約為-70℃，30分鐘后，置液氮中（-196℃)凍存。
鼠瘧原蟲：從感染瘧原蟲第3～4天的小鼠心臟取血（或摘除眼球取血)，注入試管，肝素抗凝，加入等量的10%或15%DMSO及15%或20%小牛血清為保護劑；或加入等體積的甘油、山梨醇保護液（4.2%山梨醇生理鹽水180ml加純甘油70ml)，充分混勻。按照上法裝管及凍存。也可以在1mm3陽性鼠血加0.1mm3的3.8%枸櫞酸鈉抗凝之后就裝于液氮罐提筒中，立即直接置液氮中保存，2年內(nèi)多數(shù)原蟲仍有活力。
弓形蟲：用無菌注射器吸取10%DMSO2ml，注入感染4天的小鼠腹腔，抽洗2次，抽出液混勻后即注入無菌塑料管內(nèi)（0.5～1ml/管)，凍存法同上。
陰道毛滴蟲：用無菌拭子取陰道分泌物，放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時，轉(zhuǎn)種于RPMI-1640培基中2天。取含蟲培養(yǎng)液經(jīng)1000rpm/min離心10分鐘，在沉淀中加入10%DMSO2ml，同上法分裝及凍存。
人毛滴蟲：取腹瀉患者的含蟲糞便培養(yǎng)于洛氏培養(yǎng)基中48小時，轉(zhuǎn)種于洛氏培養(yǎng)基或RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天后計算蟲數(shù)（達7×105)。加等量10%DMSO并加Tween-20于DMSO中。裝管同上法。但凍存過程應先將小管置于-10℃中15分鐘，移到液氮罐頸2分鐘，再置入液氮中凍存。
上述所用的保護劑（液)均應經(jīng)高壓滅菌，保存于4℃冰箱。RPMI-1640配制50%DMSO，用時再稀釋所需濃度，加15%或20%小牛血清，調(diào)pH至7.2。
2.復蘇與觀察在凍存1～2年，需要時從液氮罐中取出保種的小管，迅速投入37～40℃溫水中，經(jīng)4～5分鐘即溶化。取凍存的鼠瘧原蟲和弓形蟲分別經(jīng)腹腔接種2只小鼠，每只0.2ml，觀察致病情況；也可接種后4～5天分別取鼠血或腹腔液，作涂片，姬氏液染色，鏡檢原蟲。兩種毛滴蟲可用同樣方法復蘇，但需經(jīng)培養(yǎng)3～4天后，作涂片鏡檢活動滋養(yǎng)體，或染色觀察。
