細(xì)胞的興奮性和生物電現(xiàn)象(閾刺激,靜息電位,動(dòng)作電位,K平衡電位,鋒電位,Na+平衡電位,電壓鉗,膜片鉗實(shí)驗(yàn),閾電位,興奮傳導(dǎo)機(jī)制 )

　　3.經(jīng)典的電壓鉗（或電壓固定）實(shí)驗(yàn) 從上述可知，Hodgkin等對(duì)于動(dòng)作電位產(chǎn)生機(jī)制的說(shuō)明，關(guān)鍵在于膜受刺激時(shí)對(duì)Na⁺、K⁺的通透性發(fā)生了有選擇而時(shí)間亦有先后的改變，但這只是根據(jù)所測(cè)得的膜內(nèi)外電位改變對(duì)照Nernst公式進(jìn)行的推論，實(shí)驗(yàn)并沒(méi)有對(duì)膜的通透性進(jìn)行直接的測(cè)量和動(dòng)態(tài)描述。為此，他們又應(yīng)有當(dāng)時(shí)最先進(jìn)的電子學(xué)技術(shù)，設(shè)計(jì)和進(jìn)行了著名的電壓鉗（voltage clamp）實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)根據(jù)是：離子作跨膜移動(dòng)時(shí)形成了跨膜離子電流（I），而通透性亦即離子通過(guò)膜的難易程度，就是膜的電阻（R）或其倒數(shù)電導(dǎo)（G），因此所謂膜對(duì)某種離子通透性增大時(shí)，實(shí)際是膜對(duì)該離子的電導(dǎo)加大；對(duì)于帶電離子來(lái)說(shuō)，膜電導(dǎo)就是膜通透性的同義語(yǔ)。根據(jù)歐姆定律，I=VG，可知在膜兩側(cè)電位差（V）固定不變的條件下，測(cè)出的跨膜電流I的變化，就可作為膜電導(dǎo)變化的度量。測(cè)定膜在受刺激時(shí)跨膜電流的改變?cè)诩夹g(shù)上是容易的，但在這過(guò)程中要保持膜電位固定不變卻不容易；因?yàn)楫?dāng)存在跨膜離子電流時(shí)，離子的進(jìn)出膜會(huì)使不導(dǎo)電而有電容（C）特性的脂質(zhì)膜充電或放電，因而根據(jù)V=Q/C的關(guān)系（其中Q為電量，相當(dāng)于I和時(shí)間t的乘積），跨膜離子的移動(dòng)必然要引起跨膜電位的改變；實(shí)際上記錄到的動(dòng)作電位就是這種改變。正因?yàn)槿绱�，Hodgkin等自行設(shè)計(jì)了一種應(yīng)用負(fù)反饋原理的電子學(xué)裝置，使它們能在跨膜電位維持恒定（恒定的數(shù)值可由實(shí)驗(yàn)者通過(guò)實(shí)驗(yàn)裝置預(yù)先設(shè)定）的情況下，測(cè)量跨膜離子電流的強(qiáng)度改變，并由此計(jì)算出膜電導(dǎo)即膜通透性的變化情況。電壓鉗實(shí)驗(yàn)的基本原理模式圖如圖2-12所示。圖中電極1插入巨大神經(jīng)軸突內(nèi)一定距離，用來(lái)測(cè)量和監(jiān)察這一段軸突膜內(nèi)的電位，此電極先連到一個(gè)電壓放大器，再在一個(gè)示波器上顯示；電極1測(cè)得電位值經(jīng)放大后同時(shí)輸給一個(gè)負(fù)反饋放大器（FBA），這是整個(gè)儀器設(shè)計(jì)的關(guān)鍵部分，它可把測(cè)得的膜內(nèi)電位同來(lái)自一個(gè)電壓源的、由實(shí)驗(yàn)者預(yù)先設(shè)定的要求保持恒定的電位值進(jìn)行比較，如果二者有差值，F(xiàn)BA就會(huì)通過(guò)電極2向軸突膜內(nèi)輸出相應(yīng)強(qiáng)度和方向的電流，由于儀器線路的精密設(shè)計(jì)和快速反應(yīng)，電極2輸出電流的改變正足以補(bǔ)償標(biāo)本由于跨膜離子電流使膜充放電而引起的跨膜電位的變動(dòng)，于是與電極1相邊的示波器上顯示出膜內(nèi)電位固定在設(shè)定的數(shù)值，而在電流放大器IA上測(cè)得的跨膜離子電流的變化，就反映了膜電導(dǎo)的變化。

圖 2-12 電壓鉗實(shí)驗(yàn)布置模式圖

　　電壓固定實(shí)驗(yàn)獲得了許多有意義的結(jié)論。首先一點(diǎn)是，只有設(shè)定的膜內(nèi)電位固定在去極化水平時(shí)，才有可能出現(xiàn)膜的Na⁺電導(dǎo)（G_Na)和K⁺電導(dǎo)（G_k）的增大，并且設(shè)定電位愈接近零值，電導(dǎo)的增大也愈明顯；相反，如果設(shè)定的膜內(nèi)電位值是超極化的，則不可能引起跨膜離子電流和膜電導(dǎo)的改變，這一點(diǎn)以后還要談到。以圖2-13的記錄曲線為例，分析不同離子的電導(dǎo)在一次興奮過(guò)程中的變化情況。圖中最上方曲線表示在一次電壓鉗實(shí)驗(yàn)中，把膜內(nèi)電位由靜息時(shí)的－65mV突然固定（這就是（clamp）的意思）在－9mV，結(jié)果很快引起一次如曲線A的跨膜電流變化曲線，這曲線的開(kāi)始部分是內(nèi)向的，以后逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橥庀螂娏�。只記錄到�?nèi)向或外向電流還不能說(shuō)明電荷的攜帶者是何種離子，根據(jù)過(guò)去的實(shí)驗(yàn)者有理由認(rèn)為，先出現(xiàn)的內(nèi)向電流可能是Na⁺電流（I_Na），外向電流則可能是K⁺電流（I_k）。用附加的實(shí)驗(yàn)觀察證明了這點(diǎn)：假定把標(biāo)本浸浴液中的NaCI用相同摩爾數(shù)的氯化膽堿來(lái)代替，則在同樣的條件下只能記錄到較晚出現(xiàn)的曲線B，它是外向的，這顯然是因?yàn)椴荒艹霈F(xiàn)內(nèi)向的I_Na的結(jié)果；把曲線A和B逐點(diǎn)相減，就能得到曲線C，它就是內(nèi)向的I_Na；由I_Na、I_k兩條曲線，就可算出G_Na和G_k的變化曲線，其特點(diǎn)是：（1）G_Na和G_k都是電壓依從性的，只能由跨膜電位的去極化所激活，但G_Na被激活得早，是動(dòng)作電位上升支出現(xiàn)的基礎(chǔ)，而G_k激活出現(xiàn)緩慢，是動(dòng)作電位復(fù)極到靜息電位水平的基礎(chǔ)；（2）G_Na有失活（inactivation）狀態(tài)而G_k沒(méi)有此特性，其證明是圖2-13中曲線C只存在1～2ms，以后跨膜電壓雖仍固定在－9mV的水平，但G_Na早已恢復(fù)到原初水平，而代表G_k的曲線B雖然出現(xiàn)較晚，但它在設(shè)定電位持續(xù)期間一直維持在較同的水平。G_Na失活的出現(xiàn)和G_k的激活是造成神經(jīng)纖維和骨骼肌細(xì)胞表現(xiàn)短促的鋒電位的原因；在膜復(fù)極以后G_Na的失活狀態(tài)才能消失，這時(shí)G_Na才能因膜的去極化而再出現(xiàn)增大。

圖2-13　電壓鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖

將巨大神經(jīng)纖維的膜電位由原來(lái)的-65mv突然上升并固定于-9mv的水平時(shí)，

膜的離子電流的變化情況（曲線A、B、C的意義見(jiàn)正文）

　　根據(jù)圖2-13中I_Na和I_k兩條電流曲線，即可計(jì)算出同這兩者相對(duì)應(yīng)的G_Na和G_k曲線，再根據(jù)這一段膜所具有的電容的數(shù)值（有人測(cè)得每cm²的槍烏賊軸突膜的電容約為1μF），就可算出如果“允許”每一瞬間的離子移動(dòng)在電容上形成電位改變時(shí)，有可能造成怎樣的跨膜電位的改變，這正是不進(jìn)行“電壓固定”時(shí)的情況，而由此作出的電位變化曲線正好同在一般實(shí)驗(yàn)中記錄到的動(dòng)作電位的波形特點(diǎn)一致，如圖2-14所示。這進(jìn)一步說(shuō)明了電壓鉗實(shí)驗(yàn)證明動(dòng)作電位產(chǎn)生機(jī)制的正確性。

　　4．膜片鉗實(shí)驗(yàn)和單通道離子電流的記錄通過(guò)上節(jié)關(guān)于電壓門(mén)控通道的特性分析已知，所謂膜對(duì)某種離子通透性的改變，實(shí)際上決定于膜結(jié)構(gòu)中有關(guān)離子通道蛋白質(zhì)分子的功能狀態(tài)；例如，Hodgkin等測(cè)出的G_Na的變化，實(shí)際是那一段軸突膜上眾多的電壓門(mén)控式Na⁺通道因膜的去極化而開(kāi)放的結(jié)果。在Hodgkin等當(dāng)時(shí)進(jìn)行的膜電導(dǎo)改變的數(shù)學(xué)模擬中，已經(jīng)明確提示，G_Na和G_k的改變不是均勻地發(fā)生在整個(gè)膜平面上，而是與膜上某些特定的“點(diǎn)”有關(guān)，不久又發(fā)現(xiàn)，有些藥物可以選擇性地阻斷某種離子的跨膜移動(dòng)，如河豚毒可以單獨(dú)阻斷G_Na而不影響G_k，四乙基銨可以單獨(dú)阻斷G_k而不影響G_Na；以同位素標(biāo)記的河豚毒只能與膜上某些特殊的“點(diǎn)”作特異性結(jié)合，而標(biāo)記的四乙基銨只能與另一些“點(diǎn)”結(jié)合。這些實(shí)驗(yàn)以及興奮過(guò)程中離子移動(dòng)數(shù)目之多與快，逐漸使人們推斷膜結(jié)構(gòu)中有特殊的蛋白質(zhì)離子通道的存在。這說(shuō)明，“通道”概念的提出，遠(yuǎn)在通道的實(shí)質(zhì)被闡明以前，是前者促進(jìn)了對(duì)后者的進(jìn)一步探索。70年代中期由Neher和Sakmann等發(fā)展出一種能夠記錄膜結(jié)構(gòu)中單一的離子通道蛋白質(zhì)分子的開(kāi)放和關(guān)閉、亦即測(cè)量單通道離子電流和電導(dǎo)的技術(shù)，稱(chēng)為膜片鉗實(shí)驗(yàn)。

圖 2-14 電導(dǎo)變化與電位變化的關(guān)系示意圖

根據(jù)電壓鉗實(shí)驗(yàn)中測(cè)得的Na⁺電導(dǎo)（G_Na）和K⁺電導(dǎo)（G_k）的變化過(guò)程，

可以算出在膜電位不進(jìn)行人為固定時(shí)，相應(yīng)的Na⁺、K⁺離子電流在膜電容

上引起的電位變化（實(shí)線），其形狀正同在標(biāo)本上記錄到的動(dòng)作電位的波形一致

　　膜片鉗實(shí)驗(yàn)的基本原理如圖2-15A所示：用一個(gè)尖端光潔、直徑約0.5～3μm的玻璃微電極同神經(jīng)或肌細(xì)胞的膜接觸而不刺入，然后在微電極另一端開(kāi)口施加適當(dāng)?shù)呢?fù)壓，將與電極尖端接觸的那一小片膜輕度吸入電極尖端的纖細(xì)開(kāi)口，這樣在這小片膜周邊與微電極開(kāi)口處的玻璃邊沿之間，會(huì)形成緊密的封接，在理想的情況下其電阻可達(dá)數(shù)個(gè)或數(shù)十千兆歐（其物理過(guò)程目前尚不清楚），這實(shí)際上把吸附在微電極尖端開(kāi)口處的那一小片膜同其余部分的膜在電學(xué)上完全隔離開(kāi)來(lái)；如果在這一小片膜中只包含了一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)通道蛋白質(zhì)分子，那么通過(guò)此微電極就可能測(cè)量出單一通道開(kāi)放時(shí)的離子電流和電導(dǎo)，并能對(duì)單通道的其他功能特性進(jìn)行分析。

圖2-15 膜片鉗實(shí)驗(yàn)布置示意圖

A：圖中I_p為記錄到的單通道電流，V_CMD決定設(shè)定的膜電位數(shù)值

B：在大鼠胚胎骨骼肌細(xì)胞膜片上記錄到的由ACH激活的單通道
離子電流，強(qiáng)度為pA（皮安）級(jí)

　　從Neher等最初用膜片鉗技術(shù)觀察骨骼肌終板膜處的單一ACh-門(mén)控通道機(jī)能特性開(kāi)始，已經(jīng)對(duì)多種通道進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)它們一般有如下共同特性：（1）不論是化學(xué)門(mén)控或電壓門(mén)控通道，它們的開(kāi)放和關(guān)閉都是突然的，使描繪出的電流曲線呈方波狀，說(shuō)明相應(yīng)的蛋白質(zhì)分子可以從一種構(gòu)象快速地躍變到另一種構(gòu)象；（2）每種通道開(kāi)放時(shí)具有恒定的電導(dǎo)，即在恒定的情況下，只能看到“開(kāi)”或“關(guān)”兩種狀態(tài)，很少看到“半開(kāi)”或“部分開(kāi)”的情況；（3）即使是同一通道分子，每次開(kāi)放的持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)短也不一致，似乎說(shuō)明蛋白質(zhì)分子可在開(kāi)放和關(guān)閉兩種構(gòu)象之間“擺動(dòng)”，停留在某種狀態(tài)的長(zhǎng)短具有隨機(jī)的性質(zhì)；（4）在化學(xué)門(mén)控通道結(jié)合了相應(yīng)的化學(xué)信號(hào)分子，或電壓門(mén)控通道所在膜兩側(cè)處于特定的電位差的情況下，“擺動(dòng)”的次數(shù)增多，開(kāi)放的機(jī)率增大，而“失活”使開(kāi)放的機(jī)率減小。醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站quanxiangyun.cn

　　用單通道記錄可說(shuō)明在自然情況下整段膜的離子電導(dǎo)和離子電流的形成機(jī)制；以上述G_Na增大為例，它顯然是該段膜中眾多的Na⁺通道在去極化的影響下出現(xiàn)開(kāi)放的機(jī)率增加所決定的，而在每一瞬間同時(shí)出現(xiàn)的各通道的電導(dǎo)或離子電流相互疊加，于是如圖2-16B所示，這種疊加形成的Na⁺電流曲線，正好和圖2-13中的曲線C相似。

　　膜片鉗實(shí)驗(yàn)可用于各種細(xì)胞，由于微電極不刺入細(xì)胞，即使用于纖小的細(xì)胞也不致造成損傷。膜片鉗實(shí)驗(yàn)已有各種變式，如吸著在微電極尖端的小膜片可以隨電極而同原細(xì)胞脫離，把它們浸入人工浸浴液中，就可以觀察某些因素在膜的胞漿側(cè)怎樣影響通道功能；也可以形成膜的胞漿側(cè)面向微電極尖端開(kāi)口而膜表面?zhèn)让嫦蚪�浴液的�?shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ�，等等。膜片鉗實(shí)驗(yàn)也已用于細(xì)胞生物電以外的功能研究，如細(xì)胞的分泌過(guò)程等。

圖2-16 電壓門(mén)控Na⁺通道的膜片鉗記錄A：

隨著靜息電位（Em）由－110mV突然固定到－50mV，
在3次膜片鉗實(shí)驗(yàn)記錄到的離子電流 B：將144次膜片鉗記錄
到的離子電流曲線進(jìn)行平均疊加，得到一條類(lèi)似圖
2-13中曲線C的Na⁺電流曲線，說(shuō)明后者是多數(shù)Na⁺通道激活的結(jié)果

　　三、興奮的引起和興奮的傳導(dǎo)機(jī)制

　�。ㄒ唬╅撾娢缓弯h電位的引起

　　膜內(nèi)負(fù)電位必須去極化到某一臨界值時(shí)，才能在整段膜引發(fā)一次動(dòng)作電位，這個(gè)臨界值大約比正常靜息電位的絕對(duì)值小10～20mV，稱(chēng)為閾電位。例如，巨大神經(jīng)軸突的靜息電位為－70mV，它的閾電位約為－55mV。這不是由于小于閾電位的去極化不引起G_Na的增加，實(shí)際情況是這時(shí)也有一定數(shù)目的Na⁺通道開(kāi)放，但由于膜對(duì)K⁺的通透性仍大于Na⁺，因而少量的Na⁺內(nèi)流及其對(duì)膜內(nèi)電位的影響隨即被K⁺的外流所抵消，因而去極化不能繼續(xù)發(fā)展下去，不能形成動(dòng)作電位。只有當(dāng)外來(lái)刺激引起的去極化達(dá)到閾電位水平時(shí)，由于較多量Na⁺通道的開(kāi)放造成了膜內(nèi)電位較大的去極化，而此去極化已不再能被K⁺外流所抵消，因而能進(jìn)一步加大膜中Na⁺通道開(kāi)放的機(jī)率，結(jié)果又使更多Na⁺內(nèi)流增加而造成膜內(nèi)進(jìn)一步的去極化，如此反復(fù)促進(jìn)，就形成一種正反饋的過(guò)程，稱(chēng)為再生性循環(huán)，其結(jié)果使膜內(nèi)去極化迅速發(fā)展，形成動(dòng)作電位陡峭的升支，直至膜內(nèi)電位上升到近于Na⁺平衡電位的水平。由此可見(jiàn)，閾電位不是單一通道的屬性，而是在一段膜上能使Na⁺通道開(kāi)放的數(shù)目足以引起上面描述的再生性循環(huán)出現(xiàn)的膜內(nèi)去極化的臨界水平。由此也不難理解，只要刺激大于能引起再生性循環(huán)的水平，膜內(nèi)去極化速度就不再?zèng)Q定于原刺激的大��；整個(gè)動(dòng)作電位上升支的幅度也只決定于原來(lái)靜息電位的值和膜內(nèi)外的Na⁺濃度差，而與引起此次動(dòng)作電位的刺激大小無(wú)關(guān)。此即動(dòng)作電位所以能表現(xiàn)“全或無(wú)”現(xiàn)象的機(jī)制。

　　閾電位是用膜本身去極化的臨界值來(lái)描述動(dòng)作電位的產(chǎn)生條件。所謂閾強(qiáng)度，是作用于標(biāo)本時(shí)能使膜的靜息電位去極化到閾電位的外加刺激的強(qiáng)度；這就是閾強(qiáng)度和閾電位在概念上的區(qū)別。

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