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上海市臨床檢驗(yàn)中心 胡曉波 李 冰 金大鳴 張錦鋒
隨著多數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的廣泛應(yīng)用，結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化已成為主要議題。理想情況下，同一患者在不同實(shí)驗(yàn)室、不同時(shí)間段、使用不同血液分析儀，同一參數(shù)的測定結(jié)果應(yīng)該一致，只可能受生物學(xué)變異的影響。標(biāo)準(zhǔn)化或規(guī)范化的目的就是排除分析過程中的偏倚。
為了達(dá)到排除分析過程的偏倚，通常標(biāo)準(zhǔn)化工作包括兩個(gè)步驟：校準(zhǔn)，即通過調(diào)整儀器排除偏倚，和質(zhì)量控制，即保證儀器維持校準(zhǔn)的穩(wěn)定性。
一、ICSH與血細(xì)胞計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化工作
目前，國際上關(guān)于血細(xì)胞計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化工作主要由國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會（ICSH）來推動。ICSH（international council for standardization in haematology）是一個(gè)促進(jìn)和鼓勵改良方法，推動建立國際間血液分析數(shù)據(jù)可比性的標(biāo)準(zhǔn)，提供專業(yè)間交流的非官方組織。
ICSH源于1963年歐洲血液學(xué)協(xié)會成立的標(biāo)準(zhǔn)化委員會，首次討論的主題是紅細(xì)胞方法學(xué)和標(biāo)準(zhǔn)化。到1966年，正式成立國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會。目前，ICSH組成了由主席、副主席、秘書長、秘書、財(cái)務(wù)負(fù)責(zé)人和干事組成的委員會，現(xiàn)任主席是澳大利亞的W.Hughes博士，前任主席是美國的BS.Bull教授，第一副主席是英國的A.j.Bellingham教授，第二副主席是美國的E.Simson博士，秘書長是美國的O.W.van Assendelft博士，執(zhí)行秘書是英國的R.M.Rowan博士，財(cái)務(wù)負(fù)責(zé)人是美國的B.Houwen博士，干事有來自ISLH的加拿大人B.Fernandes博士，來自WHO的英國人S.M.Lewis博士，來自ISBT的新西蘭人P.Strengers博士，和美國的J.A.Koepke博士、日本的N.Tatsumi教授。
早期ICSH有4個(gè)獨(dú)立工作組負(fù)責(zé)細(xì)胞計(jì)數(shù)方面的問題，包括細(xì)胞計(jì)數(shù)組（主席，PW Helleman），血細(xì)胞壓積（PCV）組（主席，WH Crosby）,細(xì)胞大小組（主席，JM England），和血紅蛋白測定組（主席，OW van Assendelft），由SM Lewis和JF Coster作為秘書組協(xié)調(diào)工作。階段性工作在1970年慕尼黑國際血液學(xué)委員會上作了專題報(bào)道，PW Helleman回顧了計(jì)數(shù)系統(tǒng)的物理原理，稀釋液的化學(xué)成分，和如何控制這些因素，使紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞大小測量標(biāo)準(zhǔn)化，涉及有脈沖增益、閾值、重合誤差、毛細(xì)管小孔直徑、流體動力學(xué)速率和流量、細(xì)胞通過小孔的濃度的問題。R Thom在對細(xì)胞計(jì)數(shù)小孔面積的研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞流經(jīng)電極會影響脈沖電壓，證明通過小孔時(shí)，紅細(xì)胞會扭血成紡錘形，白細(xì)胞保持球形。SM Lewis建立了一種穩(wěn)定的、用戊二醛固定的血細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)物，將血液和不同動物血液（山羊、馬、人等）混合，用于核查脈沖和細(xì)胞大小分布曲線的制品，不過，因固定細(xì)胞與新鮮細(xì)胞通過檢測敏感區(qū)的方式不同，需要通過形狀因子來調(diào)節(jié)。
細(xì)胞測量組是將細(xì)胞計(jì)數(shù)、血細(xì)胞壓積、細(xì)胞大小和血紅蛋白測定組合并成立的，于1979年8月在伯林召開了第一次會議，當(dāng)時(shí)主要成員有JM England(主席，已過世),RM Rowan(秘書)，OW van Assendelf,BS Bull，W Coulter(Coulter公司，已過世)，W Groner(Technicon公司)，A Richardson-Jones,JA Koeple,SM Lewis和R Thom等，后來專家組擴(kuò)大，增加了部分血液學(xué)家，如N Tatsumi、G DOnofrio、G Klee，和生物統(tǒng)計(jì)學(xué)家CE McLaren等。同時(shí)，吸引了Sysmex公司的K Fujimoto和Abbott公司的L van Hove。
ICSH專家組考慮各種血細(xì)胞計(jì)數(shù)的問題，包括令人頭痛的參考標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)樵诩?xì)胞計(jì)數(shù)系統(tǒng)中，自然血液不穩(wěn)定，而穩(wěn)定的非自然紅細(xì)胞或人工物質(zhì)又和新鮮血液不一樣。另一個(gè)問題是，所建立參考方法的準(zhǔn)確性，目前多為手工法作為設(shè)定真值方法，如細(xì)胞計(jì)數(shù)的計(jì)數(shù)盤法，白細(xì)胞分類或網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的顯微鏡法，而大多數(shù)手工操作不能達(dá)到處自動法約1-2%的精度。
專家組首先考慮的是確定影響細(xì)胞計(jì)數(shù)的因素，建立參考方法，目前在使用電阻抗原理儀器方面達(dá)成了一致。早期，一系列問題影響儀器的設(shè)計(jì)。為了克服這些問題，專家組提出了一套方法：（1）根據(jù)脈沖體積準(zhǔn)確設(shè)置檢測器，確保能鑒別顆粒和電子噪音，要求信號，噪音比率不超過100：1；（2）要求糾正顆粒同時(shí)通過小孔的重合誤差；（3）要求細(xì)胞懸液在單位時(shí)間內(nèi)通過小孔時(shí)的流速和流量穩(wěn)定；（4）要能避免通過小孔的顆粒再循環(huán)；（5）應(yīng)選用避免顆粒黏附的材料作為管道、計(jì)數(shù)池、吸管和稀釋瓶的物質(zhì)。
經(jīng)過數(shù)十年的工作，目前在血液學(xué)方面ICSH出版了30余篇相關(guān)論文或書籍，列舉如下：
1.Recommended Methods for the Determination of Packed Cell Volume by Centrifugation.WHO DocumentLAB/89.1,1989;
Biochi Clin 14,405-10,1990
2.ICSH Recommendations for the Analysis of Red Cell,White Cell and Platelet Size Distribution Curves.Methods for Fitting a Single Reference Distribution and Assessing its Goodness of Fit.Clin Lab Haematol 12,417-31,1990
3.ICSH Guidelines for Reticulocyte Counting by Microscopy on Supravitally Stained Preparations.WHO document LBS/92.3
4.Calibration and Maintenance of Semi-Automated Haematology Equipment.WHO document LBS/92.8
5.Recommendations of the ICSH for Ethylenediaminetetraacetc Acid Anticoagulation of Blood for Blood Cell Counting and Sizing.Am J Clin Path100,371-2,1993
6.Reference Method for the Enumeration of Erythrocytes and Leucocytes.Clin Lab Haematol 16,131-8,1994
7.Guidelines for the Evaluation of Bood Cell Analyzers Including those Used for Differential Leuko cyte and Reticulocyte Counting and Cell Marker Applications.Clin Lab Haematol16,157-74,1994
8. Recommendation of the ICSH on Reporting Differential Leukocyte Counts.Clin Lab Haematol17,113,1995
9.Stability of Haemiglobin Cyanide Standards,J Clin Path49,275-7,1996
10.Recommendations for Reference Method for Haemoglobinometry in Humman Blood (ICSH Stand and 1995)and Sepecifications for International Haemiglobincyanide Standard(4th edition).J Clin Path 49,271-4,1996
11.Recommended Method for the Determination of the Haemoglobin Concentration of Blood.WHO document LAB/84.10;Revised 1991
12.Revised Recommendations for the Measurement of the Serum Iron in Human Blood.Br J Haematol 75,615-6,1990
13.Stable Lyophilized Reagents for the Serum Ferritin Assay.Clini Lab Haematol 13,297-305,1991
14.Interpretation of Measured Red Cell Mass and Plasma Volume in Adults.Br J Haematol 89,748-56,1995
15.Announcement:Nomenclature of Platelet—Specific Antigens.British Journal of Haematoloty 74,239-40,1990 Revised Guidelines for Compatibility Testing in Hospital Blood Banks:Important Changes for Quality Assurance and Procedures.Clini Lab Haematol 12,235-6,1990
16.Recommended Procedures for the Classification of Acute Leukaemias.Leuk Lympho 11,37-50,1993
17.ICSH Recommendations for Measurement of Erythrocyte Sedimentation Rate.J Clini Path 46,Rate.WHO document LAB/93.1
18.Recommendations for Standardization,Safety and Quality Control of Erythrocyte Sedimentation Rate.WHO document LAB/93.1
19.Haematology Laboratory Management and Practice.S.M.Lewis and J.A.Koepke,eds.Butterworth—Heinemann,Oxford,UK,1995
20.Huefner Memorial Symposium:Analytical and Physiological Aspects of 100 Years of Hemoglobin Research.Lab Hematol 1,30-36;143-69,1995.van Assendelft OW,Introduction 1,143-4,1995 The Oxygen—Binding Capacity of Human Hemoglobin.Zijlstra WG,Huefner Memorial Lecture:1,145-53,1995.Reference Method for the Measur-
ement of Hemoglobin.van Assendelft OW,Buursma A,1,154-
5,1995,Spectrophotometric and Oxygen-Binding Properties of Human Whole Blood.Zwart A,1,156-60,1995.CO-Oximetric Measurement of Oxyhemoglobin,Deoxyhemoglobin,and Dyshe-
moglobins in Blood:Effects of Analytical Wavelength and Reference Method Selection.Brunelle JA,Degtiarov AM,Moran RF,Race LA,1,161-4,1995.Vasoconstriction and the Effic-
acy of Hemoglobin-Based Blood Substitutes.Wislow RM,1,165-9,1995.Blood Substitutes and their Possile Interference with Routine Laboratory Hematology Tests.Houwen B,Kim JC,Change L,Clement L,Hav K,Hull B,Klein O,Mast BJ,Lebeck LK,1,30-6,1995.
21.Review Article.Standardization and Harmonization of the Blood Count.The role of ICSH.S.M.Lewis.Euro J Haem-
Atoll 4,Suppl 53,9-13,1990
22.Evaluation of a 200 mm Long Vacuum Aspiration Tube for Measurement of Erythrocyte Sedimentation Rate.M.Cas-
Well and J.Stuart.J Clin Path 44,429-30,1991
23.New evelopments inEstabishing Reference Methods in Blood Cel Counting.Lab Med 19,191-201,1995
24.Calibration and Control of Basic Blood Cell Counters.WHO/LAB/97.2
25.Methods for Reticulocyte Counting(flow cytometry & supravitaldyes);ApprovedGuideline.H44-A,Vol.17,No.15.N-CCLS/ICSH joint publication,1997
26.Proposed Reference Method for Reticulocyte Counting Based on the Determination of the Reticulocyte to Red Cell Ratio.Clin Lab Haematol 20,77-9,1998
27.Guidelines for the Organisation and Management of External Quality Assessment Schemes Using Proficiency Testing.Int J Hematol 69,45-52,1998
28.Advanced Lboratory Methods in Haematology Edited by RM Rowan,OW van Assendelft and FE Preston,Edware Arnold Ltd,433p,2002
29.Platelet Counting by the RBC/Platelet Ratio Method:A Reference Method.ICSH and ISLH.Am J Clin Path.115,460-464,2001
30.Recommendations for Single—Use Evacuated Containers for Blood Specimen Collection for Hematological Analyses.ICSH Lab Hematol 8,1-6,2002
31.Specimen Collection,Storage and Transmission to the Laboratory for Hematological Test.ISH/ICSH.Inter Hematol,75,261-268,2002
32.Recommendations for Reference Method for the Packed Cell Volume.ICSH Lab Hematol 7,148-170,2001
二、校準(zhǔn)
現(xiàn)代多參數(shù)血液分析儀的校準(zhǔn)主要通過調(diào)整每個(gè)同道的稀釋因子和信號強(qiáng)度達(dá)到。目前，至少有6個(gè)參數(shù)需要調(diào)整，包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞壓積或MCV、血紅蛋白濃度、血小板計(jì)數(shù)和白細(xì)胞分類。
調(diào)整方法有兩種：一是采用參考方法定值的新鮮血液，與儀器測定值進(jìn)行比較；二是采用中間物質(zhì)，如校準(zhǔn)品，一種穩(wěn)定化的血液，通過測定相對于全血的回收率，得到恰當(dāng)?shù)男?zhǔn)值。無論何種方法，首先必須建立每個(gè)參數(shù)參考方法/標(biāo)準(zhǔn)品，得到全血標(biāo)本的參考值。參考方法和參考品由標(biāo)準(zhǔn)化組織建立，如ICSH或NCCLS。
表1列舉了血液分析儀的參考方法�？梢�，部分參數(shù)有一種以上參考方法，部分沒有參考方法或待建立。這是造成不同儀器間偏倚因不同參考方法而異，雖然這些差異是很細(xì)微的。
表1 現(xiàn)代血液分析儀實(shí)踐指南
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參 數(shù) |
ICSH |
NCCLS |
爭論點(diǎn) |
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血紅蛋白 |
HiCN國際參考品 |
H15，HiCN |
排除紅細(xì)胞基質(zhì)渾濁 |
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紅細(xì)胞壓積 |
微量離心法 |
H7，微量離心法 |
殘留血漿 |
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白細(xì)胞計(jì)數(shù) |
ZBI方法 |
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紅細(xì)胞計(jì)數(shù) |
ZBI方法 |
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血小板計(jì)數(shù) |
流式細(xì)胞儀間接計(jì)數(shù)血小板 |
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直接/間接 |
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白細(xì)胞分類 |
流式細(xì)胞儀（待建立） |
H20，顯微鏡法 |
精度 |
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細(xì)胞大小分析 |
正態(tài)擬合 |
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紅細(xì)胞正態(tài)擬合 |
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平均紅細(xì)胞體積 |
待建立 |
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網(wǎng)織細(xì)胞計(jì)數(shù) |
流式細(xì)胞計(jì)數(shù)和活體染色 |
H44，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)和活性染色 |
目視/流式 |
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