生物化學(xué)與分子生物學(xué):第二節(jié)　蛋白質(zhì)生物合成過(guò)程

蛋白質(zhì)生的合成亦稱為翻譯（Translation)，即把mRNA分子中堿基排列順序轉(zhuǎn)變?yōu)榈罢圪|(zhì)或多肽鏈中的氨基酸排列順序過(guò)程。這也是基因表達(dá)的第二步，產(chǎn)生基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的最后節(jié)段。不同的組織細(xì)胞具有不同的生理功能，是因?yàn)樗鼈儽磉_(dá)不同的基因，產(chǎn)生具有特殊功能的蛋白質(zhì)，參與蛋白質(zhì)生物合成的成份至少有200種，其主要體第主要由mRNA、tRNA、核糖核蛋白體以及有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)因子共同組成。

原核生物與真核生物的蛋白質(zhì)合成過(guò)程中有很多的區(qū)別，真核生物此過(guò)程更復(fù)雜，下面著重介紹原核生物蛋白質(zhì)合成的過(guò)程，并指出真核生物與其不同這處。

蛋白質(zhì)生物合成可分為五個(gè)階段，氨基酸的活化、多肽鏈合成的起始、肽鏈的延長(zhǎng)、肽鏈的終止和釋放、蛋白質(zhì)合成后的加工修飾。

（一)氨基酰－tRNA的生成

氨基酸在進(jìn)行合成多肽鏈之前,必須先經(jīng)過(guò)活化,然后再與其特異的tRNA結(jié)合,帶到mRNA相應(yīng)的位置上,這個(gè)過(guò)程靠氨基酰tRNA合成酶催化,此酶催化特定的氨基酸與特異的tRNA相結(jié)合,生成各種氨基酰tRNA.每種氨基酸都靠其特有合成酶催化,使之和相對(duì)應(yīng)的tRNA結(jié)合,在氨基酰tRNA合成酶催化下,利用ATP供能,在氨基酸羧基上進(jìn)行活化,形成氨基酰-AMP,再與氨基酰tRNA合成酶結(jié)合形成三聯(lián)復(fù)合物,此復(fù)合物再與特異的tRNA作用,將氨基酰轉(zhuǎn)移到tRNA的氨基酸臂(即3"-末端CCA-OH)上(圖18-5和圖18-6)。

圖18-6　氨基酰－tRNA的生成

原核細(xì)胞中起始氨基酸活化后，還要甲酰化，形成甲酰蛋氨酸t(yī)RNA，由N10甲酰四氫葉酸提供甲酰基。而真核細(xì)胞沒(méi)有此過(guò)程。

前面講過(guò)運(yùn)載同一種氨基酸的一組不同tRNA稱為同功tRNA。一組同功tRNA由同一種氨�；鵷RNA合成酶催化。氨基酰tRNA合成酶對(duì)tRNA和氨基酸兩者具有專一性，它對(duì)氨基酸的識(shí)別特異性很高，而對(duì)tRNA識(shí)別的特異性較低。

氨基酰tRNA合成酶是如何選擇正確的氨基酸和tRNA呢？按照一般原理，酶和底物的正確結(jié)合是由二者相嵌的幾何形狀所決定的，只有適合的氨基酸和適合的tRNA進(jìn)入合成酶的相應(yīng)位點(diǎn)，才能合成正確的氨酰基tRNA�，F(xiàn)在已經(jīng)知道合成酶與L形tRNA的內(nèi)側(cè)面結(jié)合，結(jié)合點(diǎn)包括接近臂，DHU臂和反密碼子臂（圖18-7)。

圖18-7　氨基酰－tRNA合成酶與tRNA的相互作用，可見(jiàn)氨酸接受柄、

D柄、反密碼子和可變環(huán)與酶反應(yīng)

乍看起來(lái)，反密碼子似乎應(yīng)該與氨基酸的正確負(fù)載有關(guān)，對(duì)于某些tRNA也確實(shí)如此，然而對(duì)于大多數(shù)tRNA來(lái)說(shuō)，情況并非如此，人們?cè)缇椭�道，�?dāng)某些tRNA上的反密碼子突變后，但它們所攜帶的氨工酸卻沒(méi)有改變。1988年，候稚明和Schimmel的實(shí)驗(yàn)證明丙氨酸t(yī)RNA酸分子的氨基酸臂上G3：U70這兩個(gè)堿基發(fā)生突變時(shí)則影響到丙氨酰tRNA合成酶的正確識(shí)別，說(shuō)明G3：U70是丙氨酸t(yī)RNA分子決定其本質(zhì)的主要因素。tRNA分子上決定其攜帶氨基酸的區(qū)域叫做副密碼子。一種氨基酰tRNA合成酶可以識(shí)別以一組同功tRNA，這說(shuō)明它們具有共同特征。例如三種丙氨酸t(yī)RNA（quanxiangyun.cn/yaoshi/tRNAAlm/CUA,tRNAAim/GGC,tRNAAin/UGC都具有G3：U70副密碼子。)但沒(méi)有充分的證據(jù)說(shuō)明其它氨基酰tRNA合成酶也識(shí)別同功tRNA組中相同的副密碼子。另外副密碼子也沒(méi)有固定的位置，也可能并不止一個(gè)堿基對(duì)。

（二)多肽鏈合成的起始

核蛋白體大小亞基，mRNA起始tRNA和起始因子共同參與肽鏈合成的起始。

1、大腸桿菌細(xì)胞翻譯起始復(fù)合物形成的過(guò)程：

（1)核糖體30S小亞基附著于mRNA起始信號(hào)部位：原核生物中每一個(gè)mRNA都具有其核糖體結(jié)合位點(diǎn)，它是位于AUG上游8-13個(gè)核苷酸處的一個(gè)短片段叫做SD序列。這段序列正好與30S小亞基中的16s rRNA3’端一部分序列互補(bǔ)，因此SD序列也叫做核糖體結(jié)合序列，這種互補(bǔ)就意味著核糖體能選擇mRNA上AUG的正確位置來(lái)起始肽鏈的合成，該結(jié)合反應(yīng)由起始因子3（IF-3)介導(dǎo)，另外IF-1促進(jìn)IF-3與小亞基的結(jié)合，故先形成IF3-30S亞基-mRNA三元復(fù)合物。

（2)30S前起始復(fù)合物的形成：在起始因子2作用下，甲酰蛋氨酰起始tRNA與mRNA分子中的AUG相結(jié)合，即密碼子與反密碼子配對(duì)，同時(shí)IF3從三元復(fù)合物中脫落，形成30S前起始復(fù)合物，即IF2-3S亞基-mRNA-fMet-tRNAfmet復(fù)合物，此步需要GTP和Mg2+參與。

（3)70S起始復(fù)合物的形成：50S亞基上述的30S前起始復(fù)合物結(jié)合，同時(shí)IF2脫落，形成70S起始復(fù)合物，即30S亞基-mRNA-50S亞基-mRNA-fMet-tRNAfmet復(fù)合物。此時(shí)fMet-tRNAfmet占據(jù)著50S亞基的肽酰位。而A位則空著有待于對(duì)應(yīng)mRNA中第二個(gè)密碼的相應(yīng)氨基酰tRNA進(jìn)入，從而進(jìn)入延長(zhǎng)階段，以上過(guò)程見(jiàn)圖18-8和圖18-9。

圖18-8　大腸桿菌起始復(fù)合物的形成

2、真核細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的起始

真核細(xì)胞蛋白質(zhì)合成起始復(fù)合物的形成中需要更多的起始因子參與，因此起始過(guò)程也更復(fù)雜。

（1)需要特異的起始tRNA即，-tRNAfmet，并且不需要N端甲酰化。已發(fā)現(xiàn)的真核起始因子有近10種（eukaryote Initiation factor,eIF)

（2)起始復(fù)合物形成在mRNA5’端AUG上游的帽子結(jié)構(gòu)，（除某些病毒mRNA外)

（3)ATP水解為ADP供給mRNA結(jié)合所需要的能量。真核細(xì)胞起始復(fù)合物的形成過(guò)程是：翻譯起始也是由eIF-3結(jié)合在40S小亞基上而促進(jìn)80S核糖體解離出60S大亞基開(kāi)始，同時(shí)eIF-2在輔eIF-2作用下，與Met-tRNAfmet及GTP結(jié)合，再通過(guò)eIF-3及eIF-4C的作用，先結(jié)合到40S小亞基，然后再與mRNA結(jié)合。

mRNA結(jié)合到40S小亞基時(shí)，除了eIF-3參加外，還需要eIF-1、eIF-4A及eIF-4B并由ATP小解為ADP及Pi來(lái)供能，通過(guò)帽結(jié)合因子與mRNA的帽結(jié)合而轉(zhuǎn)移到小亞基上。但是在mRNA5’端并未發(fā)現(xiàn)能與小亞基18SRNA配對(duì)的S-D序列。目前認(rèn)為通過(guò)帽結(jié)合后，mRNA在小亞基上向下游移動(dòng)而進(jìn)行掃描，可使mRNA上的起始密碼AUG在Met-tRNAfmet的反密碼位置固定下來(lái)，進(jìn)行翻譯起始。

圖18-9 Initiationof translation im E.cole.The initiating tRNA,tRNAMetf,is represented by theblue line,the anticodon being the horizontal short line.The fMet-tRNAMetf isdelivered to the 30s subunit by IF2.NNN represents any codon (N for anynucleotie).Note.The ribosome also has an exit site not shown in thediagram.This site will be discussed later.

通過(guò)eIF-5的作用，可使結(jié)合Met-tRNAfmet·GTP及mRNAR40S小亞基與60S大亞基結(jié)合，形成80S復(fù)合物。eIF-5具有GTP酶活性，催化GTP水解為GDP及Pi，并有利于其它起始因子從40S小亞基表面脫落，從而有利于40S與60S兩個(gè)亞基結(jié)合起來(lái)，最后經(jīng)eIF-4D激活而成為具有活性的80SMet-tRNAfmet·mRNA起始復(fù)合物。

真核細(xì)胞翻譯起始復(fù)合物的生成見(jiàn)圖18-10和圖18-11。

圖18-10 真核細(xì)胞翻譯起始復(fù)合物的形成

圖18-11　Simplified diagram of initiation in eukaryotes.Note that severaleukaryote initiation factors besides elF2 are involved .tRNAMeti,initiatingRNA.e1F2 is the eukaryotic initiation factor corresponding to IF2 inprokaryotes.

（三)多肽鏈的延長(zhǎng)：

在多肽鏈上每增加一個(gè)氨基酸都需要經(jīng)過(guò)進(jìn)位，轉(zhuǎn)肽和移位三個(gè)步驟。

（1)為密碼子所特定的氨基酸t(yī)RNA結(jié)合到核蛋白體的A位，稱為進(jìn)位。氨基酰tRNA在進(jìn)位前需要有三種延長(zhǎng)因子的作用，即，熱不穩(wěn)定的EF（Unstable temperature,EF)EF-Tu,熱穩(wěn)定的EF(stable temperature EF,EF-Ts)以及依賴GTP的轉(zhuǎn)位因子。EF-Tu首先與GTP結(jié)合，然后再與氨基酰tRNA結(jié)合成三元復(fù)合物，這樣的三元復(fù)合物才能進(jìn)入A位。此時(shí)GTP水解成GDP，EF-Tu和GDP與結(jié)合在A位上的氨基酰tRNA分離（圖18-12)。

圖18-12 原核生物肽鏈延長(zhǎng)因子EFTu與EFTs的作用原理

圖18-13 肽鍵的形成

①核蛋白體“給位”上攜甲酰蛋氨酰　基（或肽酰)的tRNA

②核蛋白體“受體”上新進(jìn)入的氨基酰tRNA;

③失去甲酰蛋氨�；�（或肽酰)后，即將從核蛋白體脫落的tRNA;

④接受甲酰蛋氨酰基（或肽酰)后已增長(zhǎng)一個(gè)氨基酸殘基的肽鍵

（2)轉(zhuǎn)肽--肽鍵的形成（peptide bond formation)

在70S起始復(fù)合物形成過(guò)程中，核糖核蛋白體的P位上已結(jié)合了起始型甲酰蛋氨酸t(yī)RNA，當(dāng)進(jìn)位后，P位和A位上各結(jié)合了一個(gè)氨基酰tRNA，兩個(gè)氨基酸之間在核糖體轉(zhuǎn)肽酶作用下，P位上的氨基酸提供α-COOH基，與A位上的氨基酸的α-NH2形成肽鍵，從而使P位上的氨基酸連接到A位氨基酸的氨基上，這就是轉(zhuǎn)肽。轉(zhuǎn)肽后，在A位上形成了一個(gè)二肽酰tRNA（圖18-13)。

（3)移位（Translocation)

圖18-14　Diagram of the elongation process in protein synthesis followinginitation.tRNAs are shown as lue lines;AA,aamicoacyl group.The positioningshown of the EF-Tu-GTP on the tRNA and on the ribosome are arbitraty .Thisdiagram does not make evident why the ribosomal enzyme catalysing the peptidebond synthesis is called peptidyl transferase .However,if you do the next roundof synthesis yourself(see text),you will see that in all subsequent rounds ofsynthesis it is a peptide that is transferred to the incoming aminoacyltRNA-hence the name.

轉(zhuǎn)肽作用發(fā)生后，氨基酸都位于A位，P位上無(wú)負(fù)荷氨基酸的tRNA就此脫落，核蛋白體沿著mRNA向3’端方向移動(dòng)一組密碼子，使得原來(lái)結(jié)合二肽酰tRNA的A位轉(zhuǎn)變成了P位，而A位空出，可以接受下一個(gè)新的氨基酰tRNA進(jìn)入，移位過(guò)程需要EF-2，GTP和Mg2+的參加（圖18-14)。

以后，肽鏈上每增加一個(gè)氨基酸殘基，即重復(fù)上述進(jìn)位，轉(zhuǎn)肽，移位的步驟，直至所需的長(zhǎng)度，實(shí)驗(yàn)證明mRNA上的信息閱讀是從5’端向3’端進(jìn)行，而肽鏈的延伸是從氮基端到羧基端。所以多肽鏈合成的方向是N端到C端（圖18-15)。

圖18-16 The final phase of protein synthesis .The binding of release factor to a stop codon terminates translation.The completed polypeptide is released,and the ribosome dissociates into two separte subunits.

圖18-15　The elongation phase of protein synthesis on a ribosome.The three-step cycle shown is repeated over and over during the synthesos of a protein chain.An aminoacyl-tRNA moleculie binds to the A-site on the rebosome is step l,a new peptide bond is formed in sted 2,and the ribosome moves a distance of three nucleotides along the mRNA chain in step 3,ejecting an old tRNA molecule and "resetting" the ribosome so that the next aminoacyl-tRNA molecule can bind.As indicated in Figure 6-21,the p-site is drawn on the left side of the ribosome,with the A-site on the right.

（四)翻譯的終止及多肽鏈的釋放：

無(wú)論原核生物還是真核生物都有三種終止密碼子UAG，UAA和UGA。沒(méi)有一個(gè)tRNA能夠與終止密碼子作用，而是靠特殊的蛋白質(zhì)因子促成終止作用。這類蛋白質(zhì)因子叫做釋放因子，原核生物有三種釋放因子：RF1，RF2t RF3。RF1識(shí)別UAA和UAG，RF2識(shí)別UAA和UGA。RF3的作用還不明確。真核生物中只有一種釋放因子eRF，它可以識(shí)別三種終止密碼子。

不管原核生物還是真核生物，釋放因子都作用于A位點(diǎn)，使轉(zhuǎn)肽酶活性變?yōu)樗�介酶活性，將肽鏈從結(jié)合在核糖體上的tRNA的CCA末凋上水介下來(lái)，然后mRNA與核糖體分離，最后一個(gè)tRNA脫落，核糖體在IF-3作用下，解離出大、小亞基。解離后的大小亞基又重新參加新的肽鏈的合成，循環(huán)往復(fù)，所以多肽鏈在核糖體上的合成過(guò)程又稱核糖體循環(huán)（ribosome cycle)（圖18-16)。

（五)多核糖體循環(huán)：

上述只是單個(gè)核糖體的翻譯過(guò)程，事實(shí)上在細(xì)胞內(nèi)一條mRNA鏈上結(jié)合著多個(gè)核糖體，甚至可多到幾百個(gè)。蛋白質(zhì)開(kāi)始合成時(shí)，第一個(gè)核糖體在mRNA的起始部位結(jié)合，引入第一個(gè)蛋氨酸，然后核糖體向mRNA的3’端移動(dòng)一定距離后，第二個(gè)核糖體又在mRNA的起始部位結(jié)合，現(xiàn)向前移動(dòng)一定的距離后，在起始部位又結(jié)合第三個(gè)核糖體，依次下去，直至終止。兩個(gè)核糖體之間有一定的長(zhǎng)度間隔，每個(gè)核糖體都獨(dú)立完成一條多肽鏈的合成，所以這種多核糖體可以在一條mRNA鏈上同時(shí)合成多條相同的多肽鏈，這就大大提高了翻譯的效率（圖18-17)。

圖18-17 A polyribosome.Schematicdrawing showing how a series of ribosomes can simultaneously translate the samemRNA molecule.

多聚核糖體的核糖體個(gè)數(shù)，與模板mRNA的長(zhǎng)度有關(guān)，例如血紅蛋白的多肽鏈mNRA編碼區(qū)有450個(gè)核苷酸組成，長(zhǎng)約150nm。上面串連有5-6個(gè)核糖核蛋白體形成多核糖體。而肌凝蛋白的重鏈mRNA由5400個(gè)核苷酸組成，它由60多個(gè)核糖體構(gòu)成多核糖體完成多肽鏈的合成。