生物化學與分子生物學:第三節(jié)　真核基因表達調控

一、真核基因組的復雜性

與原核生物比較，真核生物的基因組更為復雜，可列舉如下。

▲真核基因組比原核基因組大得多，大腸桿菌基因組約4×106bp，哺乳類基因組在109bp數(shù)量級，比細菌大千倍；大腸桿菌約有4000個基因，人則約有10萬個基因。

▲真核生物主要的遺傳物質與組蛋白等構成染色質，被包裹在核膜內，核外還有遺傳成分(如線粒體DNA等)，這就增加了基因表達調控的層次和復雜性。

▲原核生物的基因組基本上是單倍體，而真核基因組是二倍體。

▲如前所述，細菌多數(shù)基因按功能相關成串排列，組成操縱元的基因表達調控的單元，共同開啟或關閉，轉錄出多順反子(polycistron)的mRNA；真核生物則是一個結構基因轉錄生成一條mRNA，即mRNA是單順反子(monocistron)，基本上沒有操縱元的結構，而真核細胞的許多活性蛋白是由相同和不同的多肽形成的亞基構成的，這就涉及到多個基因協(xié)調表達的問題，真核生物基因協(xié)調表達要比原核生物復雜得多。

▲原核基因組的大部分序列都為基因編碼，而核酸雜交等實驗表明：哺乳類基因組中僅約10%的序列為蛋白質、rRNA、tRNA等編碼，其余約90%的序列功能至今還不清楚。

▲原核生物的基因為蛋白質編碼的序列絕大多數(shù)是連續(xù)的，而真核生物為蛋白質編碼的基因絕大多數(shù)是不連續(xù)的，即有外顯子(exon)和內含子(intron)，轉錄后需經剪接(splicing)去除內含子，才能翻譯獲得完整的蛋白質，這就增加了基因表達調控的環(huán)節(jié)。

▲原核基因組中除rRNA、tRNA基因有多個拷貝外，重復序列不多。哺乳動物基因組中則存在大量重復序列(repetitive sequences)。用復性動力學等實驗表明有三類重復序列：①高度重復序列(highly repetitive sequences)，這類序列一般較短，長10－300bp，在哺乳類基因組中重復106次左右，占基因組DNA序列總量的10－60%，人的基因組中這類序列約占20%，功能還不明了。②中度重復序列(moderatelyrepetitive sequences)，這類序列多數(shù)長100－500bp，重復101－105次，占基因組10-40%。例如哺乳類中含量最多的一種稱為Alu的序列，長約300bp，在哺乳類不同種屬間相似，在基因組中重復3-×105次，在人的基因組中約占7%，功能也還不很清楚。在人的基因組中18S/28SrRNA基因重復280次，5SrRNA基因重復2000次，tRNA基因重復1300次，5種組蛋白的基因串連成簇重復30-40次，這些基因都可歸入中度重復序列范圍。③單拷貝序列(single copy sequences)。這類序列基本上不重復，占哺乳類基因組的50-80%，在人基因組中約占65%。絕大多數(shù)真核生物為蛋白質編碼的基因在單倍體基因組中都不重復，是單拷貝的基因。

從上述可見真核基因組比原核基因組復雜得多，至今人類對真核基因組的認識還很有限，使現(xiàn)在國際上制訂的人基因組研究計劃(human gene project)完成，繪出人全部基因的染色體定位圖，測出人基因組109bp全部DNA序列后，要搞清楚人全部基因的功能及其相互關系，特別是要明了基因表達調控的全部規(guī)律，還需要經歷很長期艱巨的研究過程。

二、真核基因表達調控的特點

盡管我們現(xiàn)在對真核基因表達調控知道還不多，但與原核生物比較它具有一些明顯的特點。

(一)真核基因表達調控的環(huán)節(jié)更多

如前所述，基因表達是基因經過轉錄、翻譯、產生有生物活性的蛋白質的整個過程。同原核生物一樣，轉錄依然是真核生物基因表達調控的主要環(huán)節(jié)。但真核基因轉錄發(fā)生在細胞核(線粒體基因的轉錄在線粒體內)，翻譯則多在胞漿，兩個過程是分開的，因此其調控增加了更多的環(huán)節(jié)和復雜性，轉錄后的調控占有了更多的分量。圖19-13扼要地列出真核基因表達的各個可能的環(huán)節(jié)。

圖19－13　真核生物基因表達調控的可能環(huán)節(jié)

圖19－13總結了以前章節(jié)敘述過的基因表達過程，并作了一些新補充。圖中標出了真核細胞在分化過程中會發(fā)生基因重排(gene rearrangement)，即胚原性基因組中某些基因會再組合變化形成第二級基因。例如編碼完整抗體蛋白的基因是在淋巴細胞分化發(fā)育過程中，由原來分開的幾百個不同的可變區(qū)基因經選擇、組合、變化，與恒定區(qū)基因一起構成穩(wěn)定的、為特定的完整抗體蛋白編碼的可表達的基因。這種基因重排使細胞可能利用幾百個抗體基因的片段，組合變化而產生能編碼達108種不同抗體的基因，其中就有復雜的基因表達調控機理。

此外，真核細胞中還會發(fā)生基因擴增(geneamplification)，即基因組中的特定段落在某些情況下會復制產生許多拷貝。最早發(fā)現(xiàn)的是蛙的成熟卵細胞在受精后的發(fā)育過程中其rRNA基因(可稱為rDNA)可擴增2000倍，以后發(fā)現(xiàn)其他動物的卵細胞也有同樣的情況，這很顯然適合了受精后迅速發(fā)育分裂要合成大量蛋白質，需要有大量核糖體。又如MTX(methotrexate)是葉酸的結構類似物，一些哺乳類細胞會對含有利用葉酸所必需的二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase, DHFR)基因的DNA區(qū)段擴增40?00倍，使DHFR的表達量顯著增加，從而提高對MTX的抗性�；�因的擴增無疑能夠大幅度提高基因表達產物的量，但這種調控機理至今還不清楚。

(二)真核基因的轉錄與染色質的結構變化相關

真核基因組DNA絕大部分都在細胞核內與組蛋白等結合成染色質，染色質的結構、染色質中NA和組蛋白的結構狀態(tài)都影響轉錄，至少有以下現(xiàn)象：

1.染色質結構影響基因轉錄　細胞分裂時染色體的大部分到間期時松開分散在核內，稱為常染色質(euchromatin)，松散的染色質中的基因可以轉錄。染色體中的某些區(qū)段到分裂期后不像其他部分解旋松開，仍保持緊湊折疊的結構，在間期核中可以看到其濃集的斑塊，稱為異染色質(heterochromatin)，其中從未見有基因轉錄表達；原本在常染色質中表達的基因如移到異染色質內也會停止表達；哺乳類雌體細胞2條X染色體，到間期一條變成異染色質者，這條X染色體上的基因就全部失活�？梢娋o密的染色質結構阻止基因表達。

2.組蛋白的作用　早期體外實驗觀察到組蛋白與DNA結合阻止DNA上基因的轉錄，去除組蛋基因又能夠轉錄。組蛋白是堿性蛋白質，帶正電荷，可與DNA鏈上帶負電荷的磷酸基相結合，從而遮蔽了DNA分子，妨礙了轉錄，可能扮演了非特異性阻遏蛋白的作用；染色質中的非組蛋白成分具有組織細胞特異性，可能消除組蛋白的阻遏，起到特異性的去阻遏促轉錄作用。

發(fā)現(xiàn)核小體后，進一步觀察核小體結構與基因轉錄的關系，發(fā)現(xiàn)活躍轉錄的染色質區(qū)段，有富含賴氨酸的組蛋白(H1組蛋白)水平降低，H2A·H2B組蛋白二聚體不穩(wěn)定性增加、組蛋白乙�；�(acetylation)和泛素化(ubiquitination)，以及H3組蛋白巰基化等現(xiàn)象，這些都是核小體不穩(wěn)定或解體的因素或指征。轉錄活躍的區(qū)域也常缺乏核小體的結構。這些都表明核小體結構影響基因轉錄。

3.轉錄活躍區(qū)域對核酸酶作用敏感度增加　染色質DNA受DNase Ⅰ作用通常會被降解成00、400……quanxiangyun.cn/zhuyuan/bp的片段，反映了完整的核小體規(guī)則的重復結構。但活躍進行轉錄的染色質區(qū)域受DNase Ⅰ消化常出現(xiàn)100－200bp的DNA片段，且長短不均一，說明其DNA受組蛋白掩蓋的結構有變化，出現(xiàn)了對DNase Ⅰ高敏感點(hypersensitive site)。這種高敏感點常出現(xiàn)在轉錄基因的5′側區(qū)(5′flanking region)、3′末端或在基因上，多在調控蛋白結合位點的附近，分析該區(qū)域核小體的結構發(fā)生變化，可能有利于調控蛋白結合而促進轉錄。

4.DNA拓撲結構變化　天然雙鏈DNA的構象大多是負性超螺旋。當基因活躍轉錄時，RNA聚合酶轉錄方向前方DNA的構象是正性超螺旋，其后面的DNA為負性超螺旋。正性超螺旋會拆散核小體，有利于RNA聚合酶向前移動轉錄；而負性超螺旋則有利于核小體的再形成。

5.DNA堿基修飾變化　真核DNA中的胞嘧啶約有5%被甲基化為5�布谆�胞嘧啶(5�瞞ethylcytidine,m5C)，而活躍轉錄的DNA段落中胞嘧啶甲基化程度常較低。這種甲基化最常發(fā)生在某些基因5′側區(qū)的CpG序列中，實驗表明這段序列甲基化可使其后的基因不能轉錄，甲基化可能阻礙轉錄因子與DNA特定部位的結合從而影響轉錄。如果用基因打靶的方法除去主要的DNA甲基化酶，小鼠的胚胎就不能正常發(fā)育而死亡，可見DNA的甲基化對基因表達調控是重要的。

由此可見，染色質中的基因轉錄前先要有一個被激活的過程，但目前對激活機制還缺乏認識。

(三)真核基因表達以正性調控為主

真核RNA聚合酶對啟動子的親和力很低，基本上不依靠自身來起始轉錄，需要依賴多種激活蛋白的協(xié)同作用。真核基因調控中雖然也發(fā)現(xiàn)有負性調控組件，但其存在并不普遍；真核基因轉錄表達的調控蛋白也有起阻遏和激活作用或兼有兩種作用者，但總的是以激活蛋白的作用為主。即多數(shù)真核基因在沒有調控蛋白作用時是不轉錄的，需要表達時就要有激活的蛋白質來促進轉錄。換言之：真核基因表達以正性調控為主導。

三、真核基因轉錄水平的調控

真核細胞的三種RNA聚合酶(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)中，只有RNA聚合酶Ⅱ能轉錄生成mRNA，以下主要討論RNA聚合酶Ⅱ的轉錄調控。

(一)順式作用組件(cis�瞐cting elements)

真核基因的順式調控組件是基因周圍能與特異轉錄因子結合而影響轉錄的DNA序列。其中主要是起正性調控作用的順式作用組件，包括啟動子(promoter)、增強子(enhancer)；近年又發(fā)現(xiàn)起負性調控作用的組件棗沉寂子(silencer)。

1.啟動子　與原核啟動子的含義相同，是指RNA聚合酶結合并起動轉錄的DNA序列。但真核同啟動子間不像原核那樣有明顯共同一致的序列，而且單靠RNA聚合酶難以結合DNA而起動轉錄，而是需要多種蛋白質因子的相互協(xié)調作用，不同蛋白質因子又能與不同DNA序列相互作用，不同基因轉錄起始及其調控所需的蛋白因子也不完全相同，因而不同啟動子序列也很不相同，要比原核更復雜、序列也更長。真核啟動子一般包括轉錄起始點及其上游約100－200bp序列，包含有若干具有獨立功能的DNA序列元件，每個元件約長7－30bp。最常見的哺乳類RNA聚合酶Ⅱ啟動子中的元件序列見表19－1。

表19－1　哺乳類RNA聚合酶Ⅱ啟動子中常見的元件

啟動子中的元件可以分為兩種：

①核心啟動子元件(core promoter element)　指RNA聚合酶起始轉錄所必需的最小的DNA序列，包括轉錄起始點及其上游－25/－30bp處的TATA盒。核心元件單獨起作用時只能確定轉錄起始位點和產生基礎水平的轉錄。

②上游啟動子元件(upstream promoter element)　包括通常位于－70bp附近的CAAT盒和GC盒、以及距轉錄起始點更遠的上游元件。這些元件與相應的蛋白因子結合能提高或改變轉錄效率。不同基因具有不同的上游啟動子元件，其位置也不相同，這使得不同的基因表達分別有不同的調控。圖19-14以人金屬硫蛋白基因為例子，說明真核基因上游啟動子元件的組織情況和各元件相應結合的轉錄因子。

圖19－14　人金屬硫蛋白基因的調控區(qū)

2.增強子　是一種能夠提高轉錄效率的順式調控元件，最早是在SV40病毒中發(fā)現(xiàn)的長約200bp的一段DNA，可使旁側的基因轉錄提高100倍，其后在多種真核生物，甚至在原核生物中都發(fā)現(xiàn)了增強子。增強子通常占100－200bp長度，也和啟動子一樣由若干組件構成，基本核心組件常為8－12bp，可以單拷貝或多拷貝串連形式存在。增強子的作用有以下特點：

①增強子提高同一條DNA鏈上基因轉錄效率，可以遠距離作用，通常可距離1－4kb、個別情況下離開所調控的基因30kb仍能發(fā)揮作用，而且在基因的上游或下游都能起作用。

②增強子作用與其序列的正反方向無關，將增強子方向倒置依然能起作用。而將啟動子倒就不能起作用，可見增強子與啟動子是很不相同的。

③增強子要有啟動子才能發(fā)揮作用，沒有啟動子存在，增強子不能表現(xiàn)活性。但增強子對動子沒有嚴格的專一性，同一增強子可以影響不同類型啟動子的轉錄。例如當含有增強子的病毒基因組整合入宿主細胞基因組時，能夠增強整合區(qū)附近宿主某些基因的轉錄；當增強子隨某些染色體段落移位時，也能提高移到的新位置周圍基因的轉錄。使某些癌基因轉錄表達增強，可能是腫瘤發(fā)生的因素之一。

④增強子的作用機理雖然還不明確，但與其他順式調控元件一樣，必須與特定的蛋白質因結合后才能發(fā)揮增強轉錄的作用。增強子一般具有組織或細胞特異性，許多增強子只在某些細胞或組織中表現(xiàn)活性，是由這些細胞或組織中具有的特異性蛋白質因子所決定的。

3.沉寂子　最早在酵母中發(fā)現(xiàn)，以后在T淋巴細胞的T抗原受體基因的轉錄和重排中證實這種負調控順式元件的存在。目前對這種在基因轉錄降低或關閉中起作用的序列研究還不多，但從已有的例子看到：沉寂子的作用可不受序列方向的影響，也能遠距離發(fā)揮作用，并可對異源基因的表達起作用。

(二)反式作用因子(trans�瞐ctingfactors)

以反式作用影響轉錄的因子可統(tǒng)稱為轉錄因子(transcription factors, TF)。RNA聚合酶是一種反式作用于轉錄的蛋白因子。在真核細胞中RNA聚合酶通常不能單獨發(fā)揮轉錄作用，而需要與其他轉錄因子共同協(xié)作。與RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ相應的轉錄因子分別稱為TFⅠ、TFⅡ、TFⅢ，對TFⅡ研究最多。表19-2列出真核基因轉錄需要基本的TFⅡ。

表19-2　RNA聚合酶Ⅱ的基本轉錄因子

以前認為與TATA盒結合的蛋白因子是TFⅡ－D，后來發(fā)現(xiàn)TFⅡ－D實際包括兩類成分：與TATA盒結合的蛋白是TBP(TATAbox binding protein)，是唯一能識別TATA盒并與其結合的轉錄因子，是三種RNA聚合酶轉錄時都需要的；其他稱為TBP相關因子(TBP�瞐ssociated factors TAF)，至少包括8種能與TBP緊密結合的因子。轉錄前先是TFⅡ－D與TATA盒結合；繼而TFⅡ－B以其C端與TBP－DNA復合體結合，其N端則能與RNA聚合酶Ⅱ親和結合，接著由兩個亞基組成的TFⅡ－F加入裝配，TFⅡ－F能與RNA聚合酶形成復合體，還具有依賴于ATP供給能量的DNA解旋酶活性，能解開前方的DNA雙螺旋，在轉錄鏈延伸中起作用。這樣，啟動子序列就與TFⅡ－D、B、F及RNA聚合酶Ⅱ結合形成一個“最低限度”能有轉錄功能基礎的轉錄前起始復合物(pre�瞚ntitiationcomplex, PIC)，能轉錄mRNA。TFⅡ－H是多亞基蛋白復合體，具有依賴于ATP供給能量的DNA解旋酶活性，在轉錄鏈延伸中發(fā)揮作用；TFⅡ－E是兩個亞基組成的四聚體，不直接與DNA結合而可能是與TFⅡ－B聯(lián)系，能提高ATP酶的活性；TFⅡ－E和TFⅡ－H的加入就形成完整的轉錄復合體(圖19?5)，能轉錄延伸生成長鏈RNA，TFⅡ－A能穩(wěn)定TFⅡ－D與TATA盒的結合，提高轉錄效率，但不是轉錄復合體一定需要的。

圖19-15　RNA聚合酶Ⅱ轉錄復合體的形成示意圖

以上所述是典型的啟動子上轉錄復合體的形成，但有的真核啟動子不含TATA盒或不通過TATA盒開始轉錄。例如有的無TATA盒的啟動子是靠TFⅡ－I和TFⅡ－D共同組成穩(wěn)定的轉錄起始復合體開始轉錄的。由此可以看到真核轉錄起始的復雜性。

不同基因由不同的上游啟動子元件組成，能與不同的轉錄因子結合，這些轉錄因子通過與基礎的轉錄復合體作用而影響轉錄的效率�，F(xiàn)在已經發(fā)現(xiàn)有許多不同的轉錄因子，看到的現(xiàn)象是：同一DNA序列可被不同的蛋白因子所識別；能直接結合DNA序列的蛋白因子是少數(shù)，但不同的蛋白因子間可以相互作用，因而多數(shù)轉錄因子是通過蛋白質－蛋白質間作用與DNA序列聯(lián)系并影響轉錄效率的(見圖19－16)。轉錄因子之間或轉錄因子與DNA的結合都會引起構象的變化，從而影響轉錄的效率。

圖19-16　轉錄因子與轉錄復合體相互作用模式圖

圖19-１6所示，作為蛋白質的轉錄因子從功能上分析其結構可包含有不同區(qū)域，①DNA結合域(DNa binding domain)，多由60－100個氨基酸殘基組織的幾個亞區(qū)組成；②轉錄激活域(activating domain)，常由30－100氨基酸殘基組成，這結構域有富含酸性氨基酸、富含谷氨酰胺、富含脯氨酸等不同種類，以酸性結構域最多見；③連接區(qū)，即連接上兩個結構域的部分。不與DNA直接結合的轉錄因子沒有DNA結合域，但能通過轉錄激活域直接或間接作用于轉錄復合體而影響轉錄效率。

與DNA結合的轉錄因子大多以二聚體形式起作用，與DNA結合的功能域常見有以下幾種：

圖19－17　HTH結構及其與DNA的結合

①螺旋�厕D角�猜菪�(helix�瞭urn�瞙elix, HTH)及螺旋-環(huán)-螺旋(helix�瞝oop�瞙elix,HLH)　這類結構至少有兩個α螺旋，其間由短肽段形成的轉角或環(huán)連接，兩個這樣的motif結構以二聚體形式相連，距離正好相當于DNA一個螺距(3.4nm)，兩個α螺旋剛好分別嵌入DNA的深溝(圖19－17)。

圖19－18　蛋白質的鋅指結構

②鋅指(zinc finger)　其結構如圖19－18所示，每個重復的“指”狀結構約含23個氨基酸殘基，鋅以4個配價鍵與4個半胱氨酸、或2個半胱氨酸和2個組氨酸相結合。整個蛋白質分子可有2?個這樣的鋅指重復單位。每一個單位可以其指部伸入DNA雙螺旋的深溝，接觸5個核苷酸。例如與GC盒結合的轉錄因子SP1中就有連續(xù)的3個鋅指重復結構。

③堿性－亮氨酸拉鏈(basic leucine zipper, bZIP)，該結構的特點是蛋白質分子的肽鏈上每隔6個氨基酸就有一個亮氨酸殘基，結果就導致這些亮氨酸殘基都在α螺旋的同一個方向出現(xiàn)。兩個相同結構的兩排亮氨酸殘基就能以疏水鍵結合成二聚體，該二聚體的另一端的肽段富含堿性氨基酸殘基，借其正電荷與DNA雙螺旋鏈上帶負電荷的磷酸基團結合。若不形成二聚體則對DNA的親和結合力明顯降低。在肝臟、小腸上皮、脂肪細胞和某些腦細胞中有稱為C/EBP家族的一大類蛋白質能夠與CAAT盒和病毒增強子結合，其特征就是能形成bZIP二聚體結構。

圖19－19　堿性亮氨酸拉鏈結構及其與DNA的結合

從上述可見：轉錄調控的實質在于蛋白質與DNA、蛋白質與蛋白質之間的相互作用，構象的變化正是蛋白質和核酸“活”的表現(xiàn)。但對生物大分子間的辨認、相互作用、結構上的變化及其在生命活動中的意義，人們的認識和研究還只在起步階段，其中許多內容甚至重要的規(guī)律我們可能至今還一無所知，有待于努力探索。