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實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸:第一節(jié) 在細(xì)菌學(xué)中的應(yīng)用

免疫細(xì)胞化學(xué)在細(xì)菌學(xué)中主要用于菌種鑒定和抗原結(jié)構(gòu)的研究。細(xì)胞都各自有其特異性抗原,應(yīng)用特異性抗體的熒光素或酶標(biāo)記物,可以鑒定任何一種細(xì)菌。已經(jīng)成功地用于鑒定幾乎所有致病菌的純培養(yǎng)。尤其是應(yīng)用免疫熒光技術(shù)具有較其他血清學(xué)方法簡(jiǎn)便、快速和敏感等優(yōu)點(diǎn),并能…

免疫細(xì)胞化學(xué)在細(xì)菌學(xué)中主要用于菌種鑒定和抗原結(jié)構(gòu)的研究。細(xì)胞都各自有其特異性抗原,應(yīng)用特異性抗體的熒光素或酶標(biāo)記物,可以鑒定任何一種細(xì)菌。已經(jīng)成功地用于鑒定幾乎所有致病菌的純培養(yǎng)。尤其是應(yīng)用免疫熒光技術(shù)具有較其他血清學(xué)方法簡(jiǎn)便、快速和敏感等優(yōu)點(diǎn),并能直接進(jìn)行細(xì)菌形態(tài)觀察。可用于鑒定的材料也比較多樣,如培養(yǎng)物、感染組織、病人分泌排泄物,外環(huán)境中采集材料(土壤、水、雜物等)。由于此法對(duì)某些傳染病原能較常規(guī)方法作出更快速的診斷,因而具有特殊意義。

免疫細(xì)胞化學(xué)方法用于研究細(xì)菌抗原結(jié)構(gòu)和形態(tài)學(xué)觀察,由于單克隆抗體的應(yīng)用,比其他方法更為有效。

圖16-1 免疫熒光在病原細(xì)菌診斷程序中的應(yīng)用時(shí)機(jī)

從患者咽部粘膜用棉拭子取標(biāo)本,作涂片用甲組溶血性鏈球菌熒光抗體染色,能夠很快作出診斷。對(duì)于痢疾桿菌、霍亂孤菌、布氏桿菌、炭疽桿菌和腦膜炎雙球菌、肺炎雙球菌等的實(shí)驗(yàn)診斷均有較好的效果(如表16-1)。

利用間接免疫熒光或酶標(biāo)記抗體法,檢測(cè)患者血清中的抗體更有價(jià)值,廣泛用于臨床診斷和流行病學(xué)研究。

表16-1 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法在細(xì)菌診斷中的應(yīng)用評(píng)價(jià)

菌種疾病標(biāo)本方法敏感性特異性意義
甲組鏈球菌急性咽峽炎
猩紅熱
咽部培養(yǎng)物DIF診斷
 急性風(fēng)濕熱     
乙組鏈球菌新生兒敗血癥陰道拭子DIF快速
 腦膜炎臨床標(biāo)本   鑒定
 牛型乳腺炎培養(yǎng)物    
致病性大腸桿菌嬰兒腹瀉大便DIF過(guò)篩
桿菌      
傷寒沙門(mén)氏菌腸傷寒大便DIF診斷
沙門(mén)氏菌腸炎大便DIF診斷
(大多數(shù)血清型)腸熱腦膜炎食品   過(guò)篩
  環(huán)境標(biāo)本    
  培養(yǎng)物    
志賀氏菌屬      
宋內(nèi)氏菌菌痢大便DIF快診
福氏菌菌痢大便DIF快診
百日咳桿菌百日咳鼻咽涂片DIF快診
流感嗜血桿菌細(xì)菌性腦膜炎脊髓DIF快診
肺炎球菌細(xì)菌性腦膜炎腦脊髓DIF快診
腦膜炎球菌細(xì)菌性腦膜炎腦脊髓DIF快診
  出血點(diǎn) (差)  
軍團(tuán)菌病小葉肺炎痰,肺滲出物DIF診斷
  肺組織切片IIF  快診
李氏菌李氏單核細(xì)胞體液涂片DIF診斷
 增多癥組織切片    
布氏桿菌布氏癥胎盤(pán)DIF診斷
(牛、羊、豬型)(人、畜)病理組織培養(yǎng)物DIF診斷
結(jié)核桿菌結(jié)核病痰及其消化液DIF診斷
胎兒孤菌孤菌病子宮陰道粘液DIF診斷
丹毒動(dòng)物感染血液、組織、培養(yǎng)物DIF較高診斷
放線菌放線菌病腺病理排泄物DIF診斷
鉤端螺旋體鉤體病尿沉渣,新鮮組織刮片或切片培養(yǎng)物DIF診斷
奈瑟氏淋球菌淋病結(jié)膜、皮膚破損,關(guān)節(jié) 液DIF較高過(guò)篩
綠膿桿菌肺炎病理組織DIF較高診斷
鼻疽桿菌類鼻疽排泄物DIF診斷
  病理組織DIF診斷
馬疽桿菌鼻疽排泄物DIF早診
  病理組織    
脆弱類桿菌敗血癥血及其他有關(guān)臨床標(biāo)本DIF較高診斷
黑色素源標(biāo)菌牙周病病變部位分泌物DIF輔診
 臟器膿腫     
梭狀芽胞桿肉毒中毒食物DIF   
菌屬動(dòng)物黑腿病     
 變部組織     
 羊炭疽大便等DIF較高輔診或診斷
 氣性壞疽     
 傷風(fēng)     
 結(jié)腸炎等     
沙眼衣原體沙眼結(jié)膜刮片DIF診斷

(引自,黃策:免疫熒光和熒光免疫。1983)

一、甲組溶血性鏈球菌的快速檢查法

(一)試劑制備

用抗甲組溶血性鏈球菌的抗體,以FITC標(biāo)記,制成熒光抗體,再用C和G鏈球菌充分吸收;或用抗I型鏈球菌M蛋白成分的血清,標(biāo)記后吸收,都有可靠的特異性。

(二)檢查方法

(1)以棉拭子擦拭患者咽部粘膜,取標(biāo)本。

(2)將拭子浸入1ml肉湯小試管內(nèi),37℃培養(yǎng)2~3h。

(3)取出棉拭了作分離培養(yǎng),常規(guī)鑒定。將肉湯液離心3~4min,3000r/min,棄上清,沉淀加0.01mol/l Ph7.2 PBS 洗滌,再離心沉淀,棄上清。

(4)以沉淀涂片,直徑約1cm,涂?jī)蓚(gè)圓形區(qū)。

(5)將標(biāo)本quanxiangyun.cn/yishi/放入95%酒精中固定1min,然后浸入PBS中洗1次,取出室溫晾干。

(6)直接法染色,左側(cè)標(biāo)本作對(duì)照,加非溶血性鏈球菌熒光抗體染色。右側(cè)加甲組溶血性鏈球菌熒光抗體染色。置濕盒中孵育20~30min,再用PBS洗2次,每次5min,振動(dòng)洗滌,濾紙吸干標(biāo)本周圍的水。

(7)加緩沖甘油封裱,立即熒光顯微鏡觀察。

免疫熒光檢出的陽(yáng)性率較培養(yǎng)法為高,因?yàn)榍罢呖梢詸z出抗菌素治療后的死菌。二者符合率達(dá)95%。

二、腦膜炎雙球菌的快速檢查法

(一)制備熒光抗體

可用多價(jià)和I、II、III、IV型單價(jià)的腦膜炎球菌抗血清,分別制備多價(jià)和單價(jià)熒光抗體。

(二)檢查方法

用患者咽拭子,腦脊液或培養(yǎng)標(biāo)本制備涂片,晾干,火焰或乙醇固定,37中染色30min,熒光顯微鏡檢查。

抗腦膜炎雙球菌的熒光抗體有很高的特異性,可以快速檢出和鑒定腦膜炎雙球菌。有人應(yīng)用免疫熒光檢查267例腦膜炎病人腦脊液中腦膜炎雙球菌,陽(yáng)性率73.4%,培養(yǎng)和普通染色則只分別為41.9%和34.4%。

三、霍亂弧菌和副霍亂弧菌的快速檢查法

霍亂和副霍亂是嚴(yán)重的傳染病,快速診斷才能及早防治。取病人糞便標(biāo)本直接涂片熒光抗體染色檢查,與常規(guī)培養(yǎng)法比較,具有快速特異和檢出率很高的優(yōu)點(diǎn)。尤其適用于急性期病人的診斷。

四、鼠疫桿菌的快速檢查法

鼠疫是烈性傳染病,快速及時(shí)的診斷對(duì)于控制流行和救治病人有決定性意義,免疫熒光快速診斷方法是一種特異和敏感的手段。直接法和間接都可應(yīng)用,以直接法更簡(jiǎn)便。

五、炭疽桿菌的快速檢查法

炭疽也是一種烈性傳染病,早期快速診斷對(duì)救治病人有決定性意義。免疫熒光檢查方法對(duì)炭疽桿菌的檢出率很高。應(yīng)用抗夾膜熒光抗體檢查炭疽桿菌有十分確定的診斷意義。也可用間接法檢測(cè)血清中抗夾膜抗體。

六、致病性大腸桿菌的快速檢查法

(1)制備當(dāng)?shù)爻R?jiàn)的致病性大腸桿菌熒光抗體。

(2)取病人大便標(biāo)本或直腸拭子以生理鹽水?dāng)嚭屯科栏,火焰固定?/p>

(3)直接法免疫熒光染色,立即熒光顯微鏡檢查。

由于本菌較其他非致病性大腸桿菌組有特殊的抗原,不易發(fā)生強(qiáng)交叉反應(yīng)。所以,在兒童腸炎和引起人群暴發(fā)性腸炎時(shí)更準(zhǔn)確、快速和簡(jiǎn)便。

七、結(jié)核桿菌的快速診斷方法

結(jié)核桿菌感染機(jī)體后可以誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體,可用間接法檢查血、胸腹水和腦脊液中的抗體。

也可用抗結(jié)核桿菌的熒光抗體直接法檢查抗原。

八、其他細(xì)菌的快速檢查方法

對(duì)軍團(tuán)桿菌、布氏桿菌、土拉桿菌、產(chǎn)氣夾膜桿菌等的快速診斷,效果良好。

九、鉤端螺旋體的檢查法

(1)根據(jù)當(dāng)?shù)劂^端螺旋體的型別制備多價(jià)抗體、標(biāo)記FITC制成熒光抗體。

(2)檢查方法:

①血液標(biāo)本的檢查:取發(fā)熱期的病人或發(fā)病動(dòng)物的血液約2ml,制取血漿,并加入鉀明礬(0.058g/ml),振蕩混勻后置室溫10~15min,然后中速離心沉淀,取沉渣涂片,晾干,95%酒精固定。免疫熒光染色,鏡檢。

②尿液標(biāo)本檢查:取病人或動(dòng)物尿液約2~3ml,高速離心,取沉渣涂片,無(wú)水乙醇固定,免疫熒光染色,鏡檢。

③臟器標(biāo)本的檢查:取發(fā)病動(dòng)物的腎臟皮質(zhì)部分,以刀片切出整齊斷面,濾紙吸去血液,再以潔凈載玻片壓印制片,晾干后以丙酮在4℃固定。經(jīng)10%甲醛固定的組織可作冰凍切片,依丙酮-乙醇-甲醇的次序固定,熒光抗體染色前以3%表面活性劑如Tween20處理切片,據(jù)稱,這樣可使熒光強(qiáng)度增加4倍。

④培養(yǎng)液檢查:同尿處理。

⑤特異性抗體的檢查:用適當(dāng)血清型的鉤端螺旋體作抗原,用間接法檢查病人血清中的特異性抗體,可用于流行病學(xué)調(diào)查和臨床追溯診斷。此檢查適用于人類和家畜等。

本法診斷鉤端螺旋體,一般只具有屬的特異性,鑒定抗體則可能達(dá)到型的特異性。

十、梅毒螺旋體的檢查法

免疫熒光細(xì)胞化學(xué)應(yīng)用于梅毒血清學(xué)診斷有很多文獻(xiàn)報(bào)道。70年代應(yīng)用PAP法又將敏感性提高了許多倍,此法已作為梅毒診斷的常規(guī)方法。用間接免疫熒光法可PAP法,取已知梅毒螺旋體作抗原,檢查病人血清中的特異性抗體。

(一)抗原制備

以標(biāo)準(zhǔn)株(如Nicol株)梅毒螺旋體感染家睪丸,約1周后待睪丸產(chǎn)生明顯炎癥,剖腹將睪丸摘除,仔細(xì)清除精索、附睪和包膜,然后以滅菌器械將其剪成薄片,置于燒瓶?jī)?nèi),加入20ml生理鹽水,振蕩30min,使螺旋體逸出,2000r/min離心10min以除去組織碎塊和血細(xì)胞,將上清高速離心(10,000r/min)30min,去上清,沉淀以5ml生理鹽水洗滌,再高速離心,洗滌,反復(fù)3次以上,以盡可能除去組織成分和家兔球蛋白,最后以pH7.2PBS(內(nèi)含0.01%硫柳汞或數(shù)滴福爾馬林以防腐)將沉淀制成敏感毫升約含10,000,000螺旋體的懸液,置4℃保存?zhèn)溆。有效期約半年。

(二)熒光抗體

用抗人IgG和IgM熒光抗體。為診斷新生兒先天性梅毒,必須用抗人IgM熒光抗體。

所有稀釋用PBS 0.1mol/L Na2HPO4-KH2PO4,0.15mol/lNaCl Ph7.2含1%Tween-80。

(三)間接免疫熒光染色方法(FIA試驗(yàn))

1.定性檢查先將待檢血清滅活。在載玻片上以白金耳取抗原液涂片,每片涂4個(gè)點(diǎn),在室溫中晾干,丙酮固定10min。各點(diǎn)分別加-1:50稀釋待檢血清;②-1:200稀釋陽(yáng)性血清;③-1:50稀釋陰性血清;④-PBS。放入濕盒,在37或室溫中放置20min,用PBS振蕩洗滌10min,再加適當(dāng)稀釋的抗人IgG和IgM熒光抗體,再同上條件下放置20min,水洗,封裱,鏡檢。結(jié)果如①、②熒光陽(yáng)性,③、④陰性,待檢血清即判斷為陽(yáng)性。陽(yáng)性時(shí)梅毒螺旋體呈明亮的黃綠色熒光,亦有人將待檢血清稀釋quanxiangyun.cn/rencai/1:200作定性檢查,這樣可排除低稀釋時(shí)正常人可出現(xiàn)的假陽(yáng)性反應(yīng),此法又稱FTA-200試驗(yàn)。

2.滴度測(cè)定如定性檢查陽(yáng)性,則被檢血清應(yīng)進(jìn)一步稀釋成1:100,1:200,1:400,1:800,1:1600……以定出染色滴度,滴度疑點(diǎn)以螺旋體發(fā)“++”熒光為標(biāo)準(zhǔn)。

(四)熒光梅毒螺旋體抗體吸收試驗(yàn)(Fluorescent treponemal antibody – absorption Test 簡(jiǎn)稱FTA-ABS)

FTA-200試驗(yàn)敏感性較差,有時(shí)查不出潛伏期和晚期梅毒。FTA-ABC試驗(yàn)不但敏感性高,而且特異性更好。方法是將非致病性螺旋體Reiter株的培養(yǎng)液于121℃高壓加熱10min,然后高速離心、沉淀,取其上清浸液作為吸附劑,并用以稀釋病人血清(1:5),然后如上法(FTA試驗(yàn))進(jìn)行染色檢查。

FTA-ABC所用的反復(fù)洗滌過(guò)的純梅毒螺旋體抗原,推薦置1.0%清蛋白、0.0375mol/l葡萄糖、0.01mol/L二氯化鎂和0.85%氯化鈉溶液(用0.1mol/L磷酸鉀緩沖液pH6.8配制)中冰凍干燥保存,其中清蛋白起保護(hù)劑的作用,葡萄糖可增加折光率,二氯化鎂維持螺旋體的形態(tài)學(xué),緩沖液穩(wěn)定pH。

(五)梅毒螺旋體的直接檢查法

取梅毒局部硬結(jié)滲出液涂片,用直接法或間接法免疫細(xì)胞化學(xué)染色,更容易發(fā)現(xiàn)隱藏在細(xì)胞碎片之間的螺旋體。免疫熒光檢出效果和暗視野檢一樣敏感。如用RB200標(biāo)記牛清蛋白作初染色,圖像更為清晰。

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