免疫學和免疫學檢驗:第三節(jié)　免疫電泳技術(shù)

免疫電泳技術(shù)是電泳分析與沉淀反應(yīng)的結(jié)合產(chǎn)物。這種技術(shù)有兩大優(yōu)點，一是加快了沉淀反應(yīng)的速度，二是將某些蛋白組分利用其帶電荷的不同而將其分開，再分別與抗體反應(yīng)，以此作更細微的分析。免疫電泳技術(shù)的種類很多，這里僅將常用的技術(shù)介紹如下。

一、免疫電泳

免疫電泳為區(qū)帶電泳與免疫雙向擴散的結(jié)合，是由Grabar和Williams（1953)首先報道的。方法是先利用區(qū)帶電泳技術(shù)將不同電荷和分子量的蛋白抗原在瓊脂內(nèi)分離開，然后與電泳方向平行在兩側(cè)開槽，加入抗血清。置室溫或37℃使兩者擴散，各區(qū)帶蛋白在相應(yīng)位置與抗體反應(yīng)形成弧形沉淀線（圖12-8)。根據(jù)各蛋白所處的電泳位置，可分為白蛋白區(qū)、球蛋白α1區(qū)、α2區(qū)、β區(qū)和γ區(qū)。各區(qū)帶常見血漿蛋白見表12-3和圖12-9。

圖12-8免疫電泳擴散模式圖A1b：白蛋白

表12-3血漿免疫電泳各區(qū)帶所含蛋白成分

圖12-9血漿蛋白各區(qū)帶位置示意圖

PreALB：前白蛋白；HP：觸珠蛋白；α₁脂蛋白；ALB：白蛋白；TRF：轉(zhuǎn)鐵蛋白

βLIP：β脂蛋白；AAT：抗胰蛋白酶；AAG：酸糖蛋白；α₂M：α₂巨球蛋白

免疫電泳沉淀線的數(shù)目和分辨率受許多因素影響。首先是抗原與抗體的比例，同其它沉淀反應(yīng)一樣，要預(yù)測抗體與抗原的最適比；其次是抗血清的抗體譜，一只動物的抗血清往往缺乏某些抗體，如將幾只動物或幾種動物的抗血清混合使用，則效果更好；電泳條件，如緩沖液、瓊脂和電泳等皆可直接影響沉淀線的分辨率。對于免疫電泳的分析，更重要的是經(jīng)驗的積累，只有多看，多對比分析，才能作出恰當?shù)慕Y(jié)論。

免疫電泳目前大量應(yīng)用于純化抗原和抗體成分的分析及正常和異常體液蛋白的識別等方面。

二、對流免疫電泳

對流免疫電泳實質(zhì)上是定向加速度的免疫雙擴散技術(shù)，其基本原理是：在瓊脂板上打兩排孔，左側(cè)各孔加入待測抗原，右側(cè)孔內(nèi)放入相應(yīng)抗體，抗原在陰極側(cè)，抗體在陽極側(cè)。通電后，帶負電荷的抗原泳向陽極抗體側(cè)，而抗體藉電滲作用流向陰極抗原側(cè)，在兩者之間或抗體的另一側(cè)（抗原過量時)形成沉淀線（圖12-10).

圖12-10對流電泳結(jié)果示意圖

①Ag為陽性；②Ag為弱陽性；③Ag為強陽性；④Ag為強陽性

IgG作為蛋白質(zhì)在電泳中比較特殊，4個亞型有不同的表現(xiàn)。G3和G4與一般蛋白無異，泳向陽極；而G1和G2則因其帶電荷少，受電滲的作用力大于電泳，所以被水分子攜裹向陰極移動。這就形成了IgG的特殊電泳形式：一部分泳向陽極，另一部分泳向陰極，www.med126.com在抗體孔兩側(cè)皆有抗體存在。因此，所謂對流只是部分IgG的電滲作用造成。

三、火箭免疫電泳

火箭免疫電泳技術(shù)又稱作單向電泳擴散免疫沉淀試驗，它是由單向擴散發(fā)展起來的一項定量技術(shù)，實質(zhì)上是加速度的單向擴散。在含抗體的瓊脂板一端打一排抗原孔；加入待測標本后，將quanxiangyun.cn/wsj/抗原置陰極端，用橫距2～3mA/cm的電流強度進行電泳。抗原泳向陽極，在抗原抗體比例恰當處發(fā)生結(jié)合沉淀。隨著泳動抗原的減少，沉淀逐漸減少，形成峰狀的沉淀區(qū)，狀似火箭（圖12-11)�？贵w濃度保持不變，峰的高度與抗原量呈正比，用標本中的抗原含量。

圖12-11火箭電泳圖

①②③為標本；④⑤⑥為標準抗原

火箭電泳操作時應(yīng)注意以下幾點：

1．所用瓊脂可選擇無電滲或電滲很小的，否則火箭形狀不規(guī)則。

2．注意電泳終點時間，如火箭電泳頂部呈不清晰的云霧狀或圓形皆提示未達終點。

3．標本數(shù)量多時，電泳板應(yīng)先置電泳槽上，搭橋并開啟電源（電流要小)后再加樣。否則易形成寬底峰形，使定量不準。

4．作IgG定量時，由于抗原和抗體的性質(zhì)相同，火箭峰因電滲呈紡綞狀。為了糾正這種現(xiàn)象，可用甲醛與IgG上的氨基結(jié)合（甲�；�)，使本來帶兩性電荷的IgG變?yōu)橹粠щ姾�，加快了電泳速度，抵消了電滲作用，而出現(xiàn)伸向陽極的火箭峰。

火箭電泳作為抗原定量只能測定μg/ml以上的含量，如低于此水平則難于形成可見的沉淀峰。加入少量¹²⁵I標記的標準抗原共同電泳，則可在含抗體的瓊脂中形成不可見的放射自顯影技術(shù)。根據(jù)自顯影火箭峰降低的程度（競爭法)可計算出抗原的濃度。放射免疫自顯影技術(shù)可測出ng/ml的抗原濃度。

四、免疫固定電泳

免疫固定電泳（immunofixationelectrophoresis，IFE)是Alper和Johnson（1969)推薦的一項有實用價值的電泳加沉淀反應(yīng)技術(shù)。可用于各種蛋白質(zhì)的鑒定。該法原理類似免疫電泳，不同之處是將血清直接加于電泳后蛋白質(zhì)區(qū)帶表面，或?qū)⒔�有抗血清的濾紙貼于其上，抗原與對應(yīng)抗體直接發(fā)生沉淀反應(yīng)，形成的復(fù)合物嵌于固相支持物中。將未結(jié)合的游離抗原或抗體洗去，則出現(xiàn)被結(jié)合固定的某種蛋白。區(qū)帶電泳支持物選用濾紙、醋纖膜、瓊脂或聚丙烯酰胺皆可。

免疫固定電泳最常用于M蛋白的鑒定。方法是：先將患者血清或血漿在醋纖膜上或瓊脂上作區(qū)帶電泳（一般作6條標本)，達到預(yù)定時間后取下，加抗血清，由上而下依次加抗人全血清、抗IgG、抗IgA、抗IgM、抗κ輕鏈和抗λ輕鏈。必要時還可加抗Fab、抗Fc等特殊抗血清。作用30min后洗去游離蛋白質(zhì)，染色后則可被固定的相應(yīng)M蛋白成分。