豬細小病毒及其鑒別診斷研究
感謝大夫為我快速解答——該如何治療和防治
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豬細小病毒是全世界豬群繁殖障礙最常見的病原之一。本病于1967年在英國報道以來，目前已廣泛流行于世界各地。我國于80年代初開始研究此病，中國獸藥監(jiān)察所1.982年在國內(nèi)率先分離到該病毒。相關(guān)統(tǒng)計資料顯示豬細小病毒病已在我國普遍存在和流行。 豬細小病毒感染的經(jīng)濟損失也是巨大的。據(jù)美國每年由該病引起的繁殖損失達450萬美圓，我國趙占民調(diào)查北京15個豬細小病毒陽性場，1288頭初產(chǎn)母豬，產(chǎn)木乃伊和弱胎率59.16%，產(chǎn)死胎率49.17；廣西調(diào)查2024頭初產(chǎn)母豬，非正常子占產(chǎn)子總數(shù)的42.2%。 豬細小病毒感染引起母豬，特別是初產(chǎn)母豬產(chǎn)出死胎、畸形胎、木乃伊胎、
流產(chǎn)及病弱仔豬。敏感母豬在妊娠期最初70天內(nèi)感染此病毒就會發(fā)生此病。母豬返情、假孕（不分娩)、窩產(chǎn)仔數(shù)減少以及豬群總的繁殖性能下降。 但近些年來的研究發(fā)現(xiàn)該病毒是導(dǎo)致圓環(huán)病毒感染的一個協(xié)同病原，是后者流行的一個原因。而圓環(huán)病毒則是引起豬體質(zhì)下降、消瘦、
腹瀉、呼吸困難，導(dǎo)致豬斷奶后多系統(tǒng)衰弱的主要病原。 1 病原學(xué) 豬細小病毒的病原是豬細小病毒，屬于細小病毒科，細小病毒屬。病毒粒子呈圓形或六邊形、無囊膜，直徑為20nm，基因組為單股。病毒在豬原代細胞如：
豬腎、豬睪丸細胞及傳代細胞如等細胞上都能生長繁殖，并出現(xiàn)細胞病變，用免疫熒光技術(shù)可查出胞漿中的病毒抗原，病毒在細胞中可產(chǎn)生核內(nèi)包涵體。病毒能凝集人、候、豚鼠、小鼠及雞的紅細胞。 細小病毒毒力有強弱之分，（1)是強毒株，血清陰性懷孕母豬感染后將導(dǎo)致病
毒血癥，并通過胎盤垂直感染使胎兒死亡；（2)是一種細胞適應(yīng)后的弱毒株，懷孕母豬感染后不能經(jīng)過胎盤感染胎兒，而被用作弱毒預(yù)苗株。毒株感染細胞中存在干擾缺損顆粒，可干擾或減患的復(fù)制，次種干擾作用為宿主機體建立起抵抗的免疫反應(yīng)提供足夠的時間，從而阻止病毒血癥的產(chǎn)生和繼發(fā)胎盤感染。 本病毒耐熱性強，在4℃極其穩(wěn)定，可長期保存。56℃30min加熱處理后其感染性和凝集紅細胞的能力不喪失，在70℃2h仍不喪失起感染性和血凝活性，到85℃5min才失活。 該病毒對各種消毒劑有很強的抵抗力。對乙醚、氯仿等脂溶劑不敏感，短時間
胰酶處理不僅對病毒懸液沒有影響，而且還能提高其感染效價。甲醛蒸汽和紫外線也需要很長時間才能殺死病毒。PPV在圈舍及排泄物中自然條件下可生存至少14周。用0.5%漂
白粉或氫氧化鈉5min可殺死PPV，而2%
戊二醛則需20分鐘，3%甲醛需2小時。 2
流行病學(xué) 豬是已知的唯一易感動物，不同年齡、性別的家豬和
野豬都可感染。據(jù)報道，在牛、
綿羊、
貓、豚鼠、小鼠和大鼠的血清中也存在特異性抗體，來自病豬場的鼠類，其抗體陽性率高于陰性豬場的鼠類。 帶毒豬是主要傳染源，病毒可通過胎盤傳給胎兒，形成垂直傳播，同時一側(cè)子宮角內(nèi)的胎兒感染PPV后，可傳播給另一側(cè)子宮角的胎兒。本病除可經(jīng)胎盤感染和交配、人工受精感染外，母豬、育肥豬和公豬主要是通過被感染的食物、環(huán)境經(jīng)呼吸道和消化道或生殖道感染。帶毒豬的分泌物和排泄物可保持感染數(shù)月，污染的圈舍是PPV的主要儲藏所，所以污染的豬舍在病豬移出后空圈四個半月，經(jīng)通常方法清掃后，當(dāng)再放進易感豬時，仍有可能被感染， 子宮內(nèi)感染的仔豬至少可帶毒9周，有些具有免疫耐性的可能終生帶毒和排毒。感染本病毒的母豬所產(chǎn)的死胎、活胎、仔豬及子宮分泌物中均含有高滴度的病毒。 被感染公豬的精細胞、精索、附睪和副性腺都可分離出病毒，在其配種是易傳給易感母豬。 熒光抗體檢查證明病毒主要分布于豬體內(nèi)一些增生迅速的組織，如淋巴生發(fā)中心、結(jié)腸固有層、腎間質(zhì)、鼻甲骨膜等。 3 臨床表現(xiàn) 本病常見于初產(chǎn)母豬，一般呈地方流行性或散發(fā)。在本病發(fā)生后，豬場可能連續(xù)幾年不斷地出現(xiàn)母豬繁殖失敗。母豬懷孕早期感染時，其胚胎、胎豬死亡率可高達80%～100%。 豬急性感染PPV1～6天后可產(chǎn)生病毒血癥，1～2周可通過糞便排毒，7～9天可在血清中檢測掃血凝抗體。 仔豬和母豬的急性感染通常都表現(xiàn)為亞臨床病例，但在其體內(nèi)很多組織器官（尤其是淋巴組織)中均可發(fā)現(xiàn)有病毒存在。母豬不同孕期感染，可分別造成死胎、木乃伊胎、流產(chǎn)等不同癥狀。在懷孕30～50天感染時主要是木乃伊胎。懷孕50～60天感染是多出現(xiàn)死產(chǎn)。懷孕70天感染的母豬則常出現(xiàn)流產(chǎn)癥狀。母豬在懷孕中后期受感染后也可發(fā)生經(jīng)胎盤的感染，但此時胎兒常能在子宮內(nèi)存活而無明顯的臨床癥狀。在懷孕期70天后，大多數(shù)胎兒能對病毒感染產(chǎn)生有意義的免疫應(yīng)答而存活，但這些仔豬常帶有抗體和病毒。當(dāng)早期胚胎受感染時，病毒在子宮內(nèi)的傳播可能較不常見，因為胚胎死亡后可被母體迅速吸收而有效地清除了子宮內(nèi)的傳染源。 此外，本病還可引起產(chǎn)仔瘦小、弱仔，母豬發(fā)情不正常，久配不孕等癥狀。對公豬的受精率或性欲沒有明顯影響。 4 病變 眼觀病變?yōu)槟肛i子宮內(nèi)膜有輕微炎癥，胎盤有部分鈣化，胎兒在子宮有被溶解、吸收的現(xiàn)象。感染胎兒還可見充血、
水腫、出血、體腔積液、
脫水（木乃伊化)及壞死等病變。 組織學(xué)病變?yōu)槟肛i的妊娠黃體萎縮，子宮上皮組織和固有層有局灶性或彌散性單核細胞浸潤。感染胎兒死亡后可見多種組織和器官有范圍廣泛的細胞壞死、炎癥和核內(nèi)包涵體。在大腦灰質(zhì)、白質(zhì)和軟腦膜偶以增生的外膜細胞、組織細胞和漿細胞形成的血管套為特征的腦膜腦炎變化，一般認為這是本病的特征性病變。 5 診 斷 如果發(fā)生流產(chǎn)、死胎、胎兒發(fā)育異常等情況而母豬沒有明顯的臨床癥狀，同時有其他證據(jù)可認為是一種傳染病時，應(yīng)考慮到本病的可能性。但最后確診必須依靠實驗室檢查�？蓪⒁恍┠灸艘粱夯蜻@些胎兒的肺送實驗室進行診斷。大于70日齡的木乃伊化胎兒、死產(chǎn)仔豬和初生仔豬則不宜送檢，因其中可能含有干擾檢驗的抗體。 本病應(yīng)注意與豬偽
狂犬病、豬乙型腦炎和布魯氏病等鑒別診斷。 6 防 制 本病尚無特效的治療方法。主要采取的措施：控制帶毒豬傳人豬場。在引進豬是應(yīng)加強檢疫，當(dāng)抗體滴度在1∶256以下或陰性是方可準許引進。引進豬應(yīng)隔離飼養(yǎng)2周后，在進行一次抗體測定，證實是陰性者，方可與本場豬混飼。一旦發(fā)病，應(yīng)將發(fā)病母豬、仔豬隔離或淘汰。所有豬場環(huán)境、用具應(yīng)嚴密消毒，并用血清學(xué)方法對全群豬進行檢查，對陽性相豬應(yīng)采取隔離或淘汰。以防進一步發(fā)展，對豬進行免疫接種，有良好的預(yù)防效果。美國一研制成弱毒疫苗和滅活苗，對初產(chǎn)母豬進行免疫接種，能有效預(yù)防母豬感染細小病毒。滅活苗免疫期可達4個月以上。我國已研制出滅活疫苗，在母豬配種前1～2個月左右免疫，可預(yù)防本病發(fā)生。仔豬的母源抗體可持續(xù)14～24周，在抗體效價1∶80是可抵抗豬細小病毒感染，因此，在斷奶時將仔豬從污染豬群移到?jīng)]有本病污染的地區(qū)飼養(yǎng)，可以培育出血清陰性豬群。 綜合以上種種，鑒于細小病毒危害的嚴重性和臨床癥狀的不明顯性，早期診斷是預(yù)防的關(guān)鍵，所以找尋一種簡便、準確的實驗室診斷方法將是我們所要解決的首要問題。 目前，我們已經(jīng)建立了許多種細小病毒的診斷方法。主要包括（1)病原學(xué)方面：進行病毒的細胞培養(yǎng)和鑒定或血凝實驗或熒光抗體染色實驗。用熒光抗體檢查病毒抗原是一種可靠和敏感的診斷方法。但其需要熒光顯微鏡這一特殊的設(shè)備，因此限制了該方法在臨床的推廣。 （2)血清學(xué)方面：血清中和實驗、血凝抑制實驗、酶聯(lián)免疫吸附實驗、瓊脂擴散實驗和補體結(jié)合實驗等，都可用于檢測本病毒的體液抗體。其中常規(guī)診斷方法是血凝抑制實驗。病料可采取母
豬血清，也可用70日齡以上感染胎兒的心血或組織浸出液。被檢血清先經(jīng)56℃30滅活，加入50%豚鼠紅細胞（最終濃度)和等量的高嶺土，搖勻后放室溫15min，經(jīng)2000r/min離心10min取上清，以除掉血清中的非特異性凝集素和抑制因素。抗原用4個血凝單位的標(biāo)準血凝素，紅細胞用0.5%豚鼠紅細胞懸液。判定標(biāo)準暫定1∶256。但其存在一定的不足之處，如實驗所需的紅細胞要現(xiàn)配現(xiàn)用，最多只能保存1周，被檢血清的處理也較為煩瑣。 可見，使用方便、經(jīng)濟適用、簡單易行、準確可靠，適應(yīng)規(guī)�；B(yǎng)殖的早期診斷和及時預(yù)防的需要的鑒別診斷方法為人們眾望所歸。為此，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)病毒研究室研制開發(fā)出豬細小病毒鑒別診斷試劑盒。 7 診斷試劑盒研制的生物學(xué)基礎(chǔ) 細小病毒作為最小最簡單的一類單鏈線狀 DNA病毒，具獨特的基因結(jié)構(gòu)，其中多種自主型細小病毒的基因組結(jié)構(gòu)非常相似。PPV具有細小病毒的一般特性，其基因組為單鏈線狀負性DNA。其兩端均為發(fā)夾結(jié)構(gòu)，3’端102個堿基的回文序列被 2個大小約10個堿基的短回文序列間隔，從而形成“Y”形結(jié)構(gòu)，而5’端127個堿基的回文序列，被24個堿基的短回文序列間隔，折疊成“U”形結(jié)構(gòu)。PPV基因組含有兩個互不重疊的主要開放閱讀框架（OpenReading Frame)。位于3’端的主要編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白（VP，VP2)；5’端的主要編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白（NSl，NS2，NS3)。非結(jié)構(gòu)蛋白的功能表現(xiàn)為： （1)非結(jié)構(gòu)蛋白在細小病毒DNA復(fù)制和RNA轉(zhuǎn)錄過程中具有重要作用，NSl蛋白具有內(nèi)切酶作用和共價結(jié)合5’端序列的特性，從而能共價結(jié)合復(fù)制型DNA5’末端并具有特意部位的解鏈活動。 NSl蛋白有A型保守序列，這類序列是與ATPase和GTPase相關(guān)的ATP和GTP結(jié)合位點，并具有解旋作用，它拓展了病毒DNA的末端的空間構(gòu)型，起始病毒DNA的復(fù)制，所以NSl蛋白是細小病毒DNA復(fù)制所必需的。 （2)NSl蛋白與細小病毒的組裝密切相關(guān)。PPV新合成的單鏈DNA基因組的5’端通過共價鍵與NSl聯(lián)結(jié)，在隨后的病毒包裝過程中NSl被去掉并連在病毒粒子的外層。 （3)非結(jié)構(gòu)蛋白NSl具有抗原性，并刺激機體產(chǎn)生抗體。NSl雖然是微量的，但在病毒復(fù)制中，能持續(xù)刺激機體產(chǎn)生抗體。當(dāng)豬感染PPV后，體內(nèi)將產(chǎn)生抗NSl的抗體，而使用滅活苗免疫的豬則沒有這種抗體一基于此，利用桿狀病毒體外重組表達的NSl建立了區(qū)分PPV野毒感染和滅活疫苗免疫豬的鑒別診斷方法 8 診斷試劑盒研制的過程 本研究在對PPV中國株的NSl基因進行PCR擴增、克隆和序列測定的基礎(chǔ)上，進一步對細小病毒進行了深入研究，利用大腸桿菌表達系統(tǒng)成功表達了PPVNSl蛋白作為抗原，建立間接ELISA診斷方法。 通過大量臨床血清的檢測證實： （1)特異性實驗：用NSl包被微孔板，分別檢測豬
口蹄疫、豬偽狂犬等豬的陽性血清，檢測結(jié)果都呈陰性。表明，此診斷方法對豬細小病毒病的檢測具有特異性，是一種準確而使用簡便的診斷方法。 （2)穩(wěn)定性實驗證實診斷試劑盒在室溫下放置的有效使用期可以達到5個月。 （3)靈敏性實驗證實其比常規(guī)的診斷方法，如HI和LAT等更為靈敏，尤其可以鑒別診斷自然感染和滅活苗免疫豬群。 （4)此診斷方法對于大量血清檢測具有省時、便捷、準確的特點，更適應(yīng)規(guī)�；B(yǎng)殖的早期診斷和及時預(yù)防的需要。
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做好疫苗接種
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導(dǎo)致母豬流產(chǎn)，死胎
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