動物生化學重要技術(層析技術)

親和層析中，一對互相識別的分子互稱對方為配體，如激素可認為是受體的配體，受體也可以認為是激素的配體。
親和層析是將配體固定在固相載體上，并且將其裝入層析柱中，當樣品通過層析柱時，由于配體和相對應的生物大分子有專一性的親和作用，將某種生物大分子吸附在柱中，樣品中的其他組分不產(chǎn)生這種專一性的結(jié)合，而直接流出色譜柱。然后，便可以利用洗脫劑將吸附在柱中的生物大分子洗脫下來。
親和層析法具有高度的專一性，而且層析過程簡單、快速，是一種理想的有效分離純化生物大分子的手段。
(二)操作方法
親和層析的分離方法隨分離的物質(zhì)不同而不同，一般的程序如下：
選擇配體→選擇偶聯(lián)的凝膠→偶聯(lián)配體→裝柱→平衡→上樣→洗滌未結(jié)合的雜質(zhì)→洗脫目標物質(zhì)→樣品。
１、配體的選擇　能與分離物質(zhì)牢固、特異和可逆結(jié)合的物質(zhì)都可以作為配體。選擇配體有兩個條件：
第一，生物大分子與配體間具有合適的親和力，親和力太強，洗脫條件劇烈，易造成生物大分子失活，親和力太小，解離容易，結(jié)合率不高；
第二，是配體要具有雙重功能，既有可牢固與載體結(jié)合的基團，結(jié)合后又不影響生物大分子與配體間的親和力。
２、載體的選擇及與配體的偶聯(lián)　
對于一個成功的親和色譜分離來說，一個重要的因素就是選擇合適的固體載體。
實踐證明，瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠是親和色譜的優(yōu)良載體。瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)開放，通過性好，酸堿處理時相當穩(wěn)定，物理性能也好。瓊脂糖凝膠上的羥基在堿性條件下極易被溴化氰活化成亞氨基碳酸鹽，并能在溫和的條件下與氨基等基團作用而引入配體。親和色譜中最為常用的瓊脂糖凝膠的型號是Sepharose-4B。在瓊脂糖與溴化氰活化后，再與生物大分子結(jié)合形成親和色譜填料是親和色譜中最為常用的一種。
３、裝柱、上樣　親和色譜吸附劑制備好后，裝入色譜柱中，色譜柱無特殊要求，常用短而粗的柱子。根據(jù)純化物質(zhì)的量、吸附能力來選擇。吸附能力高的常用短柱，吸附能力弱的常用長一些的柱子。
樣品為固體時，常用起始緩沖溶液溶解，若為液體，要通過透析等方法將溶液轉(zhuǎn)換為起始緩沖溶液。上樣量可根據(jù)柱子的吸附容量來推算，通常為吸附容量的1/3或更低，對于吸附力弱的物質(zhì)，上樣量按照1/10為佳。在樣品上柱后，使用10倍柱體積的緩沖溶液將不結(jié)合的雜質(zhì)清洗掉獲得最尖銳的洗脫峰和最小洗脫體積的流速為最佳流速。
４、洗脫　從柱中洗脫目標產(chǎn)物是親和色譜是否成功的關鍵。quanxiangyun.cn通常采用降低目標產(chǎn)物與配體之間的親和力的方式進行洗脫�？捎靡徊椒ɑ蜻B續(xù)改變洗脫劑濃度的方式將目標產(chǎn)品洗脫下來。當?shù)鞍踪|(zhì)與配體間的作用力過強時，可用一步法，甚至可先讓洗脫劑在柱子中停留半小時的方法。
改變pH同樣也能改變配體與蛋白質(zhì)間的作用力，因此通過改變pH也是親和色譜分離目標產(chǎn)物的一種方法。另一種方法是通過改變離子強度來洗脫目標產(chǎn)品，有時也用變性劑來洗脫目標產(chǎn)品。因此，親和色譜分離目標產(chǎn)品的方法并不是一成不變的，可根據(jù)樣品的性質(zhì)和自己的條件進行選擇。
對于吸附得十分牢固的生物大分子，必須使用較強的酸或堿作為洗脫劑，或在洗脫液中加入破壞蛋白質(zhì)的試劑，如脲、鹽酸胍。這種洗脫方式往往造成不可逆的變化，使純化的對象失去生物學活性。因此，對于洗脫得到的蛋白質(zhì)溶液應立即進行中和、稀釋或透析。

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