公開(公告)號
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CN100363485C
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公開(公告)日
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2008.01.23
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申請(專利)號
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CN200410027944.4
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申請日期
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2004.07.07
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專利名稱
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制備重組人粒細胞集落刺激因子用工程菌的發(fā)酵方法
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主分類號
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C12N1/20(2006.01)I
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分類號
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C12N1/20(2006.01)I;C12P21/02(2006.01)I
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分案原申請?zhí)? |
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優(yōu)先權(quán)
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申請(專利權(quán))人
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深圳新鵬生物工程有限公司
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發(fā)明(設(shè)計)人
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李政海;李 靜;李繼東
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地址
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518057廣東省深圳市南山區(qū)高新技術(shù)園北區(qū)郎山二路
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頒證日
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國際申請
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進入國家日期
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專利代理機構(gòu)
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深圳市博銳專利事務(wù)所
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代理人
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張 明
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國省代碼
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廣東;44
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主權(quán)項
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一種制備重組人粒細胞集落刺激因子用工程菌的發(fā)酵方法,所述工程菌為DH5α-PBV220-hGCSF,其發(fā)酵過程包括種子液培養(yǎng)和分批補料發(fā)酵,其特征在于: 所述種子液培養(yǎng)包括以下子步驟: 1)菌種的篩選:從菌種保存庫中取出所述工程菌,劃LB平板30℃培養(yǎng)過夜,挑取單菌落接種于含100μg/ml氨芐青霉素的5ml LB試管中培養(yǎng),至OD600值為0.4-0.6,再于42℃培養(yǎng)4小時,離心收集菌體,SDS-PAGE分析,用重組人粒細胞集落刺激因子表達量最高的克隆作為發(fā)酵用種子,分裝甘油保存,每批發(fā)酵取用一支; 2)一級種子液培養(yǎng):將種子按2%的體積比接種到含2YT種子培養(yǎng)基的50ml三角瓶中,30℃,200r/min搖床培養(yǎng),至OD600值為0.6-1.0; 3)二級種子液培養(yǎng):將一級種子液以1%的體積比接種到含200ml 2YT種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中,30℃,250r/min,搖床培養(yǎng)12-16小時,至OD600值為3.5-6.5,鏡檢無雜菌,菌種形態(tài)正常,即為發(fā)酵用種子; 所述分批補料發(fā)酵包括以下子步驟: A.發(fā)酵前的準備:將8L發(fā)酵培養(yǎng)基接入到20L的發(fā)酵罐中,115℃滅菌30分鐘; B、基本發(fā)酵:滅菌后,待培養(yǎng)基溫度降到30℃時,按接種量10%體積比接入二級種子液,30℃,培養(yǎng)8小時,開始誘導(dǎo)表達; C、誘導(dǎo)發(fā)酵:誘導(dǎo)溫度為42℃,誘導(dǎo)4小時,結(jié)束發(fā)酵; 上述分批補料發(fā)酵子步驟B和C中,通過補加4mol/L氫氧化鈉控制pH為7.0-7.1,通過調(diào)節(jié)發(fā)酵罐的空氣流速和轉(zhuǎn)速,控制溶氧值為50%;并且當OD600值為2時,開始補料,補料方式為每小時補加補料I和II各100ml; 所述補料I的配方為:葡萄糖300g,硫酸銨50g,加純化水定容至1L; 所述補料II的配方為:酵母粉300g,酪蛋白水解物20g,維生素B1 0.1g,加純化水定容至1L。
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摘要
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一種制備重組人粒細胞集落刺激因子用工程菌的發(fā)酵方法,所述工程菌為DH5α-PBV220-hGCSF,其發(fā)酵過程包括種子液培養(yǎng),包括以下子步驟:①.菌種的篩選;②.一級種子液培養(yǎng);③.二級種子液培養(yǎng);和分批補料發(fā)酵,包括以下子步驟:①.發(fā)酵前的準備;②.基本發(fā)酵:按接種量10%體積比接入二級種子液,30℃,培養(yǎng)8小時,開始誘導(dǎo)表達;③.誘導(dǎo)發(fā)酵:誘導(dǎo)溫度為42℃,誘導(dǎo)4小時,結(jié)束發(fā)酵;上述分批補料發(fā)酵子步驟②和③中,控制pH為7.0-7.1,溶氧值為50%;并且當OD600值為2時,開始補料,每小時補加一定量的補料Ⅰ和Ⅱ。本發(fā)酵方法,為解決人粒細胞集落刺激因子制備上存在的表達率偏低、菌體產(chǎn)量偏低、活性偏低以及成本偏高等問題提供了可能。
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國際公布
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