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一種抗癌靶向可調(diào)控基因-病毒的構(gòu)建方法

公開(公告)號 CN1453361A  
公開(公告)日 2003.11.05  
申請(專利)號 CN03128996.7  
申請日期 2003.05.30  
專利名稱 一種抗癌靶向可調(diào)控基因-病毒的構(gòu)建方法  
主分類號 C12N15/86  
分類號 C12N15/86;C12N15/63;C12N15/12;C12N15/861;C12N7/01;A61K48/00;A61P35/00  
分案原申請?zhí)?  
優(yōu)先權(quán)  
申請(專利權(quán))人 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院  
發(fā)明(設(shè)計(jì))人 裴子飛;李兵華;鄒衛(wèi)國;孫蘭英;顧錦法  
地址 200031上海市徐匯區(qū)岳陽路320號  
頒證日  
國際申請  
進(jìn)入國家日期  
專利代理機(jī)構(gòu) 上海智信專利代理有限公司  
代理人 肖劍南  
國省代碼 上海;31  
主權(quán)項(xiàng) 一種抗癌靶向可調(diào)控基因-病毒的構(gòu)建方法,其特征在于包括下列步驟:一、克隆質(zhì)粒pRS-hTERT/Trail的構(gòu)建反式作用元件表達(dá)盒,即表達(dá)盒-1的構(gòu)建:用限制性內(nèi)切酶消化質(zhì)粒pAd/hTERT,回收hTERT啟動子片段再插入到克隆載體pBluescript的多克隆位點(diǎn),得到pBS-hTERT;用限制性內(nèi)切酶切割pBS-hTERT,將含有hTERT啟動子片段克隆到pRS-17的相應(yīng)位點(diǎn),替換出pRS-17原有的TTR啟動子,得到質(zhì)粒pRS-hTERT;抗癌基因表達(dá)盒,即表達(dá)盒-2的構(gòu)建:從pCA13-Trail中用限制性內(nèi)切酶切出Trail基因,克隆到中間載體的相應(yīng)位點(diǎn),然后再通過基因克隆的方法插入pRS-hTERT的ClaI位點(diǎn),得到克隆質(zhì)粒pRS-hTERT/Trail;二、包裝質(zhì)粒pGL-hTERT/Trail的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶把克隆質(zhì)粒pRS-hTERT/Trail的兩個(gè)表達(dá)盒切出,連接到質(zhì)粒pGL的酶切位點(diǎn)上,得到包裝質(zhì)粒pGL-hTERT/Trail;三、病毒的包裝用限制性內(nèi)切酶切割包裝質(zhì)粒pGL-hTERT/Trail使之線性化,與輔助病毒共轉(zhuǎn)染到包裝細(xì)胞293Cre4中;四、病毒的收集純化挑選單克隆,鑒定后大規(guī)模培養(yǎng),收集細(xì)胞培養(yǎng)物,經(jīng)梯度離心純化病毒。  
摘要 本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種抗癌靶向可調(diào)控基因-病毒的構(gòu)建方法。本發(fā)明構(gòu)建了攜帶有反式作用元件(trans-activator,TA)表達(dá)盒以及抗癌基因表達(dá)盒的無腸腺病毒或AAV。這兩個(gè)表達(dá)盒結(jié)構(gòu)相對獨(dú)立、功能直接相關(guān),使得目的基因的表達(dá)受hTERT控制僅限于腫瘤細(xì)胞并受小分子藥物RU486的誘導(dǎo),需要時(shí)打開,不需要時(shí)關(guān)閉,這樣既避免了外源基因產(chǎn)物對正常組織的傷害,也實(shí)現(xiàn)了外源基因的長久表達(dá)(至少一年以上)?朔藗鹘y(tǒng)的腺病毒載體靶向性差、目的基因表達(dá)不受控制以及表達(dá)時(shí)間短等缺點(diǎn)。本發(fā)明構(gòu)建的無腸腺病毒載體,可以開發(fā)出有效的治療腫瘤的抗癌新藥。  
國際公布  
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