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一種重組雞α干擾素的生產(chǎn)方法及其重組載體

公開(公告)號(hào) CN1594568A  
公開(公告)日 2005.03.16  
申請(qǐng)(專利)號(hào) CN200410041075.0  
申請(qǐng)日期 2004.06.24  
專利名稱 一種重組雞α干擾素的生產(chǎn)方法及其重組載體  
主分類號(hào) C12N15/21  
分類號(hào) C12N15/21;C12N15/10;C12N15/81;C07H21/00;C12N15/63  
分案原申請(qǐng)?zhí)?  
優(yōu)先權(quán)  
申請(qǐng)(專利權(quán))人 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)  
發(fā)明(設(shè)計(jì))人 陳溥言;蔡梅紅  
地址 210095江蘇省南京市衛(wèi)崗1號(hào)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)科技處錢寶英  
頒證日  
國際申請(qǐng)  
進(jìn)入國家日期  
專利代理機(jī)構(gòu) 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司  
代理人 樓高潮  
國省代碼 江蘇;32  
主權(quán)項(xiàng) 一種重組雞α干擾素的生產(chǎn)方法,包括:(一)重組到畢赤酵母上的雞α干擾素的基因序列的擴(kuò)增A)引物的設(shè)計(jì):引物1:5‘AATTCAATTCTGCAACCACCTTCGCCCC’3引物2:5‘CCGATCTAGAGTTTGGGGATTA’3B)雞全血淋巴細(xì)胞總RNA的提取取500μL培養(yǎng)以ConA刺激4~10h的雞全血分離的淋巴細(xì)胞的懸液,向其中加入800μLTripure細(xì)胞裂解液,振蕩混勻后,置于室溫下10min,然后向其中加入200μL氯仿,混勻后于室溫下靜置5min分鐘,再于12000g4℃下離心15min;吸取上清,向其中加入0.5倍體積的異丙醇,充分混勻后于室溫下靜置15min,隨后在12000g4℃下離心10min;排盡管內(nèi)液體,向管內(nèi)加入1mL70%乙醇進(jìn)行洗滌,混勻后,7500g4℃離心5min;棄去液體,待管壁稍干燥后加入20μLDEPC處理的超純水溶解,即得到雞淋巴細(xì)胞總RNA;C)含有雞α干擾素基因序列cDNA第一條鏈的合成用新鮮提取的淋巴細(xì)胞的總RNA進(jìn)行RT-PCR,具體加樣如下:細(xì)胞總RNA9.2μL5×反轉(zhuǎn)錄Buffer4.0μL10mMdNTP2.0μL25mMMgCI20.8μLRnasin1.0μL引物11.0μL引物21.0μL將上述反應(yīng)混合物于掌式離心機(jī)上稍作離心,然后于在PCR儀;上65℃15min后加入反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV1.0μL,后42℃1h,94℃5min后結(jié)束反應(yīng);D)PCR反應(yīng)體系如下:ddH2O34μL10×PCRBuffer4.0μL25mmol/LMg2+1.4μLRT產(chǎn)物10μLrTaq0.6μL總體積50μL在PCR儀上設(shè)置94℃5min,隨后94℃1min,56℃1min,72℃1min,共30個(gè)循環(huán),結(jié)束循環(huán)后72℃10min;對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定獲得的雞α干擾素基因大小為488bp;(二)含有雞α干擾素成熟蛋白基因酵母表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定利用通過RT-PCR擴(kuò)增的雞α干擾素成熟蛋白基因有ECORI和XbaI兩個(gè)酶切位點(diǎn),把雞α干擾素成熟蛋白基因切下后與已經(jīng)同樣兩種限制性內(nèi)切酶酶切的pPICZa-A酵母載體相連,再經(jīng)ECORI和XbaI酶切,切下大小為488bp的條帶則可以鑒定為陽性;(三)感受態(tài)酵母菌的制備:挑取畢赤酵母X-33平板上的一個(gè)單菌落轉(zhuǎn)接于2mlYPD試管中,28℃250rpm恒溫?fù)u過夜活化12h后,取500ul的活化后的酵母菌液轉(zhuǎn)接于50ml的含有無菌5mlYPD培養(yǎng)基的三角瓶中,瓶口用三層滅菌紗布扎緊,28℃恒溫?fù)u床250rpm搖蕩培養(yǎng)20h左右。待菌液OD600=1.3-1.5時(shí),4℃1500g離心4min收獲細(xì)胞。細(xì)胞依次用1000ml冰預(yù)冷水和1000ml冰預(yù)冷的1M山梨醇洗滌,4℃1500g離心5min,最后用0.8ml冰預(yù)冷的1M山梨醇懸浮菌體,分裝不同的ep管后,置4℃待用;(四)含有雞α干擾素成熟蛋白基因的酵母表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化入酵母菌  
摘要 本發(fā)明一種重組雞α干擾素的生產(chǎn)方法及其重組載體屬于用分子生物學(xué)方法獲得的基因工程生物制品。將雞α干擾素的基因序列通過電轉(zhuǎn)化方式整合到酵母上的特定位置。采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源基因,表達(dá)外源蛋白的純度高于70%,經(jīng)過65636倍稀釋發(fā)現(xiàn)能完全抑制100-1000TCID50的水皰性口炎病毒的攻擊。雞α干擾素對(duì)VSV和禽流感病毒的轉(zhuǎn)錄、翻譯階段抑制能力尤其明顯,對(duì)新城疫病毒、傳染性法氏囊病毒等也都有較強(qiáng)的抑制作用,而且還有強(qiáng)大抗腫瘤、抗增殖作用,對(duì)雞的馬立克氏病毒也具有較強(qiáng)的抑制作用。  
國際公布  
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