| 公開(公告)號 | CN1609231A |
| 公開(公告)日 | 2005.04.27 |
| 申請(專利)號 | CN03132205.0 |
| 申請日期 | 2003.10.22 |
| 專利名稱 | 中藥材gDNA種質(zhì)特異性微陣列芯片制備方法 |
| 主分類號 | C12Q1/68 |
| 分類號 | C12Q1/68 |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 李同祥;王進科;陸祖宏;南京新益華集團有限公司 |
| 發(fā)明(設(shè)計)人 | 李同祥;王進科;陸祖宏 |
| 地址 | 210096江蘇省南京市四牌樓2號東南大學分子與生物分子實驗室 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進入國家日期 | |
| 專利代理機構(gòu) | |
| 代理人 | |
| 國省代碼 | 江蘇;32 |
| 主權(quán)項 | 中藥材gDNA種質(zhì)特異性微陣列芯片制備方法，其特征在于該制備方法包括如下步驟：(a)提取各樣本的gDNA，用識別4個堿基的平頭末端酶酶切，酶切產(chǎn)物為平頭末端，理論上每44即256個堿基就有一個酶切位點，其酶切片段大小在150-500bp之間。(b)通過抑制性差減雜交(SSH)對在一個樣本(設(shè)其為Tester即試驗者)中存在而在另一樣本(設(shè)其為Driver即軀趕者)中不存在的差異gDNA片段進行PCR擴增富集。(c)PCR產(chǎn)物用T-vecter克隆轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取白色重組子克隆，挑取的克隆轉(zhuǎn)入96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)。取0.5μl培養(yǎng)菌液，用5′端修飾有氨基的nestedPCRprimer1(圖1(4))和nestedPCRprimer2(圖1(5))在96微孔板中擴增差異克隆。(d)gDNA用識別4個堿基的平頭末端酶酶切后，連接接頭adaptor3，用引物primer3擴增時摻入dCTP-Cy3或dCTP-Cy5進行標記的擴增子其PCR產(chǎn)物直接用于雜交篩選。(e)將所有差異克隆用點樣儀點樣于硅烷化處理的玻片上，在一定條件下分別用熒光標記的不同樣本擴增子(amplicons)雜交，用激光掃描儀進行掃描檢測，篩選獲取種質(zhì)特異性探針。(f)將獲得的所有種質(zhì)特異性探針制作成微陣列。 |
| 摘要 | 中藥材gDNA種質(zhì)特異性微陣列芯片制備方法是以名貴中藥材(石斛)為材料，提取其不同品種gDNA，用識別4個堿基的(如RsaI酶)酶切，酶切產(chǎn)物為平頭末端，通過抑制性差減雜交(SSH)，獲取不同種間差異克隆片段并點樣于玻片，采用dCTP-Cy3和dCTP-Cy5標記的gDNA擴增子與其雜交篩選到種質(zhì)特異性探針，以這些大量的探針制備成可用于平行檢別多個品種及真、偽的中藥種質(zhì)鑒定芯片。本發(fā)明以gDNA為鑒別的信息載體，在基因組(gDNA)水平上尋找獲得種質(zhì)特異性探針制備低成本、高通量、平行鑒別多種及真?zhèn)蔚闹兴幏N質(zhì)鑒定芯片。獲得的大量種質(zhì)特異性探針，對中藥的基因組特征研究及探索中藥的遺傳進化和生物學分類提供大量的信息，對于建立中藥材種間、真?zhèn)舞b別系統(tǒng)基因庫標準基因圖譜具有非常重要的價值，同時，為道地藥材和非道地藥材質(zhì)量差異的研究，以及優(yōu)質(zhì)中藥材種質(zhì)的篩選和育種栽培研究提供技術(shù)支撐，對中藥的高通量鑒定，實現(xiàn)中藥質(zhì)量控制，促進中藥現(xiàn)代化有廣泛的應(yīng)用價值。 |
| 國際公布 |
