一種高通量直接定向克隆構(gòu)建重組腺病毒的方法
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公開(公告)號(hào)
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CN1624145A
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公開(公告)日
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2005.06.08
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申請(專利)號(hào)
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CN200410060972.6
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申請日期
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2004.10.19
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專利名稱
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一種高通量直接定向克隆構(gòu)建重組腺病毒的方法
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主分類號(hào)
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C12N15/861
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分類號(hào)
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C12N15/861;C12N15/66
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分案原申請?zhí)? |
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優(yōu)先權(quán)
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申請(專利權(quán))人
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湖北大學(xué)
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發(fā)明(設(shè)計(jì))人
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馬立新;張娟;陶然
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地址
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430062湖北省武漢市武昌區(qū)寶集安
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頒證日
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國際申請
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進(jìn)入國家日期
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專利代理機(jī)構(gòu)
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武漢金堂專利事務(wù)所
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代理人
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丁齊旭
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國省代碼
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湖北;42
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主權(quán)項(xiàng)
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一種高通量直接定向克隆構(gòu)建重組腺病毒的方法，主要包括一個(gè)已有的腺病毒表達(dá)載體和經(jīng)PCR引物擴(kuò)增的目的基因，其特征在于通過對已有的腺病毒載體系統(tǒng)進(jìn)行成功的定點(diǎn)誘變和同源重組的修飾，在該載體中引入了兩個(gè)唯一的特殊限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)序列和一個(gè)抗性基因表達(dá)單元，在擴(kuò)增目標(biāo)基因的一對PCR引物的5’端分別引進(jìn)3～5個(gè)特定的堿基，在dTTP、或者dATP、或者dGTP、或者dCTP存在條件下，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)T4DNA聚合酶消化后產(chǎn)生的粘性末端與載體雙酶切得到的粘性末端匹配，從而可以定向克隆在經(jīng)ClaI、AscI雙酶切的載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過抗性篩選及PCR鑒定或功能鑒定得到重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒經(jīng)線性化后，可直接轉(zhuǎn)染腺病毒包裝細(xì)胞系，得到重組腺病毒粒子。
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摘要
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本發(fā)明提出了一種能夠直接定向與用T4DNA聚合酶消化經(jīng)特殊設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接，然后通過抗性篩選，從而一步構(gòu)建得到重組腺病毒質(zhì)粒的方法。得到的重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)過限制性內(nèi)切酶PacI線性化，轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物包裝細(xì)胞系，就能夠得到成熟的重組腺病毒。利用本發(fā)明能夠高通量構(gòu)建重組腺病毒，以盡可能真實(shí)的表達(dá)哺乳動(dòng)物cDNA，且構(gòu)建重組腺病毒的實(shí)驗(yàn)周期短，成本低，特別適合大規(guī)模表達(dá)哺乳動(dòng)物來源的cDNA。是一個(gè)非常有效的構(gòu)建重組腺病毒的方法。
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國際公布
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