| 公開(公告)號(hào) | CN1215171C |
| 公開(公告)日 | 2005.08.17 |
| 申請(專利)號(hào) | CN01116754.8 |
| 申請日期 | 2001.04.21 |
| 專利名稱 | 生產(chǎn)截短型重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2成熟肽的方法 |
| 主分類號(hào) | C12N15/12 |
| 分類號(hào) | C12N15/12;C12N15/63;C12N15/70;C07K14/51;C12P21/02 |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 杭州華東醫(yī)藥(集團(tuán))公司基因技術(shù)研究所 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 徐放 |
| 地址 | 310011 浙江省杭州市莫干山路866號(hào) |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 |
| 代理人 | 韓介梅 |
| 國省代碼 | 浙江;33 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 生產(chǎn)截短型重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2成熟肽的方法，其特征在于該方法包括以下步驟：1)人工合成編碼重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2成熟肽107個(gè)氨基酸殘基的核苷酸序列，并在第一個(gè)氨基酸殘基密碼子之前加上了起始密碼子ATG和限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，將第二個(gè)氨基酸精氨酸殘基突變?yōu)?a class="channel_keylink" href="http://quanxiangyun.cn/pharm/2009/20090107125645_48921.shtml" target="_blank">賴氨酸殘基和在最后一個(gè)氨基酸殘基的密碼子之后加上終止密碼子TAA和限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，構(gòu)成截短型重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2成熟肽的基因SEQID：NO：1長度：324bp類型：脫氧核糖核酸鏈數(shù)：雙鏈幾何結(jié)構(gòu)：線性來源：人工合成特征：編碼重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2成熟肽的107個(gè)氨基酸殘基的序列5′ATGAAAAAACTGAAATCCTCCTGCAAAAGACATCCGCTGTATGTGGATTTTAGCGATGTGGGCTGGAACGATTGGATTGTGGCGCCGCCGGGCTATCATGCGTTTTATTGCCATGGCGAATGCCCGTTTCCGCTGGCGGATCATCTGAACTCCACCAACCATGCGATTGTGCAGACCCTGGTGAACTCTGTGAACAGCAAAATTCCGAAAGCGTGCTGTGTGCCGACCGAACTGAGCGCGATTTCGATGCTGTATCTGGATGAAAACGAAAAAGTGGTGCTGAAAAACTATCAGGATATGGTGGTGGAAGGTTGTGGCTGTCGCTAA3′以下將人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2成熟肽用英文縮寫B(tài)MP-2-108表示人BMP-2-108的氨基酸殘基序列：MKKLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSKIPKACCVPTELSAISMLYLDENEKVVLKNYQDMVVEGCGCR2)構(gòu)建含BMP-2-108基因的表達(dá)載體，將合成的BMP-2-108基因和含有與該基因相同限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的載體分別用相關(guān)限制性內(nèi)切酶切開，酶切溫度為25～38℃，酶切時(shí)間為1～5小時(shí)，然后將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1～2％的瓊脂糖凝膠電泳，用常規(guī)方法從凝膠中回收并純化載體和基因兩個(gè)DNA片段，再將兩個(gè)片段同時(shí)置于T4DNA連接酶反應(yīng)緩沖液中，加入T4DNA連接酶，在4～22℃下進(jìn)行為時(shí)1小時(shí)-1周的連接反應(yīng)，其中所使用的基因表達(dá)載體或?yàn)橛没瘜W(xué)試劑誘導(dǎo)插入基因表達(dá)的載體或?yàn)橥ㄟ^溫度變化誘導(dǎo)插入基因表達(dá)的載體；3)采用分子克隆操作技術(shù)，以常規(guī)的氯化鈣法制備大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞：用無菌鉑絲直接蘸取凍存的大腸桿菌，在LB平板表面劃線，于25～38℃下培養(yǎng)10～20小時(shí)，將1個(gè)分隔良好的單菌落接種到50-100毫升LB培養(yǎng)液中，在25～38℃下，以150～300次/分鐘的振蕩速度培養(yǎng)至OD600＝0.3-1.0，將培養(yǎng)物裝于離心管內(nèi)，置冰上5～20分鐘，隨后，將培養(yǎng)物于2～6℃離心5～20分鐘，速度為1500～2000g，將離心所得的沉淀再用10～20毫升冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液懸浮之后，第二次在2～6℃下離心5～7分鐘，速度為1000～1500g，將離心所得沉淀再用10～20毫升冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液懸浮，冰上放置28～32分鐘，然后第三次在2～6℃下離心5～7分鐘，速度為1000～1500g，將離心所得沉淀用2～5毫升冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液懸浮，最后按每管100～200微升的量將懸浮液分裝于無菌離心管中，將管口密封后，立即凍于-70℃；4)將上述第2)步所得的連接反應(yīng)物與第3)步所得的感受態(tài)細(xì)菌混勻，在冰上放置10～50分鐘，接著在42℃的水浴中放置30～150秒，再冰浴1～10分鐘，然后加入0.5～5毫升的LB培養(yǎng)基，在28～38℃的水浴或培養(yǎng)箱中溫浴20～120分鐘，隨后，將150～250微升被轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂布到含有相應(yīng)抗生素的LB平板上，將平板置于室溫下直至液體被吸收后，倒置平板，于25～38℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～30小時(shí)后，即可出現(xiàn)重組菌的菌落，至此完成質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化過程；5)從轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌的固體平板上挑取單菌落，接種于裝有1～10毫升LB培養(yǎng)液的試管中，在25～38℃的溫度下中速振蕩培養(yǎng)6～15小時(shí)，再對(duì)收獲的菌體采用常規(guī)的堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA；6)將上述抽提的DNA用限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，酶切溫度為30～37℃，酶切時(shí)間為1～3小時(shí)，正確重組子中應(yīng)當(dāng)含有300～400bp的BMP-2-108基因及5～6kb的載體DNA的酶切片段，凡能切出上述大小酶切片段的克隆即為轉(zhuǎn)化了BMP-2-108基因的克隆，構(gòu)建基因工程菌獲得成功；7)在含葡萄糖的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)基因工程菌：按1％的接種量將基因工程菌接入5～10毫升的LB培養(yǎng)基中，以振蕩速度100～200次/分培養(yǎng)2～3小時(shí)，對(duì)以化學(xué)試劑誘導(dǎo)插入基因表達(dá)的載體，培養(yǎng)溫度是30～32℃，對(duì)通過溫度變化誘導(dǎo)插入基因表達(dá)的載體，培養(yǎng)溫度是28～30℃；8)BMP-2-108基因的誘導(dǎo)表達(dá)，在進(jìn)行7)步驟后，按1％的比例，將培養(yǎng)物接種到含有200～500毫升LB培養(yǎng)基的三角燒瓶中，以200～300次/分的振蕩速度，在步驟7)指定的培養(yǎng)溫度下將基因工程菌培養(yǎng)至OD600＝1.2～1.4，培養(yǎng)時(shí)間為10～12小時(shí)，然后，接入大罐中的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，接種量為在5份培養(yǎng)液中加入1份種子液，pH7.0，對(duì)于以化學(xué)試劑誘導(dǎo)插入基因表達(dá)的基因工程菌，培養(yǎng)溫度為30～32℃，攪拌速度100～600轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)4個(gè)小時(shí)加入終濃度為1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)3～4小時(shí)，然后在8000～10000轉(zhuǎn)/分離心收集菌體，對(duì)于通過溫度變化誘導(dǎo)插入基因表達(dá)的基因工程菌則將培養(yǎng)溫度迅速升到42～45℃，并在劇烈震蕩下繼續(xù)培養(yǎng)3～4小時(shí)，然后在8000～10000轉(zhuǎn)/分離心收集菌體；9)用物理方法或化學(xué)試劑裂解細(xì)胞，抽提重組蛋白質(zhì)，經(jīng)復(fù)性，分離，純化后，獲得本發(fā)明的產(chǎn)品截短型重組人 |
| 摘要 | 本發(fā)明涉及一種構(gòu)建基因工程菌生產(chǎn)截短型重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2成熟肽(rhBMP-2-108)的方法，該方法通過構(gòu)建含截短型人BMP-2基因的基因工程菌而得到表達(dá)量高的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2成熟肽，更易于純化和復(fù)性，因而有更高的生物活性。本發(fā)明的基因工程菌所產(chǎn)生的人截短型BMP-2的量達(dá)到細(xì)菌總可溶蛋白量的30～50％，本發(fā)明建立的重組蛋白分離純化技術(shù)簡便實(shí)用，有利于大量生產(chǎn)醫(yī)療用的BMP-2，為其用于臨床，造福病人奠定基礎(chǔ)。 |
| 國際公布 |
