| 公開(公告)號(hào) | CN1687449A |
| 公開(公告)日 | 2005.10.26 |
| 申請(qǐng)(專利)號(hào) | CN200510016681.1 |
| 申請(qǐng)日期 | 2005.04.05 |
| 專利名稱 | 腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制劑篩選模型的制備方法 |
| 主分類號(hào) | C12Q1/34 |
| 分類號(hào) | C12Q1/34 |
| 分案原申請(qǐng)?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(qǐng)(專利權(quán))人 | 中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 張曉宇;楊曉達(dá);倪嘉纘 |
| 地址 | 130022吉林省長(zhǎng)春市人民大街5625號(hào) |
| 頒證日 | |
| 國(guó)際申請(qǐng) | |
| 進(jìn)入國(guó)家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | |
| 代理人 | |
| 國(guó)省代碼 | 吉林;22 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制劑篩選模型的制備方法，其特征在于分以下步驟完成：一、模型建立過(guò)程：固定腺苷同型半胱氨酸水解酶反應(yīng)在0-10℃進(jìn)行，所用試劑在0-10℃預(yù)冷；1)偶聯(lián)：取活化載體，離心，棄上清，用1mmol·L-1鹽酸和pH＝7.4磷酸緩沖液或Tris-鹽酸緩沖液各洗滌3-5次，加入一定量的腺苷同型半胱氨酸水解酶，混勻，50-200rpm振蕩4-8小時(shí)，反應(yīng)完畢后，離心，上清與封閉步驟中所得到的洗滌液合并，用于測(cè)定蛋白濃度，固定化酶的蛋白濃度＝加入的蛋白總濃度-上清中的蛋白濃度；2)封閉：得到的沉淀用10-100mmol·L-1pH7.0-7.4的Tris-HCl緩沖液封閉過(guò)夜，離心，用10-100mmol·L-1pH8.0-8.5的Tris-HCl-NaCl和1-10mmol·L-1pH4-5的HAc-NaAc兩種緩沖溶液輪流洗滌3-5次，得洗滌液；3)活化：加入含有輔酶的磷酸緩沖液進(jìn)行活化，室溫放置1小時(shí)，再用pH7.0-7.4的10mmol·L-1磷酸緩沖液洗滌至上清280、340nm吸收值穩(wěn)定；二、抑制劑篩選待篩選藥物與固定化酶反應(yīng)，測(cè)定腺苷同型半胱氨酸水解酶的活性判定該物質(zhì)是否該酶的抑制劑；取500μL-1mLpH7.0-7.4的磷酸緩沖液中含不同濃度淫羊藿提取物及4μg酶蛋白的固定化酶，30-40℃溫育30min，加Ado、Hcy至終濃度1mmol·L-1、4mmol·L-1，30-40℃水浴5-10min，5mol·L-1H2SO4中止反應(yīng)，離心，HPLC檢測(cè)上清液中腺苷同型半胱氨酸的含量，根據(jù)其含量變化反映樣品對(duì)腺苷同型半胱氨酸水解酶活性的抑制程度，抑制率超過(guò)50％者可以確定為腺苷同型半胱氨酸水解酶的抑制劑。 |
| 摘要 | 本發(fā)明屬于一種酶抑制劑的篩選模型。腺苷同型半胱氨酸水解酶是一個(gè)抗炎、抗病毒、抗腫瘤、治療心腦血管疾病的重要靶酶。調(diào)節(jié)酶的活性能治療相關(guān)疾病，本發(fā)明旨在尋找合適的抑制劑，以求發(fā)現(xiàn)有價(jià)值的新藥，應(yīng)用腺苷同型半胱氨酸水解酶和活化的瓊脂糖凝膠為基本原料，通過(guò)偶聯(lián)方法，得到固定化酶，添加氧化型輔酶I(NAD+)，以保證酶的活性。該酶抑制劑的高通量篩選，特別適用于對(duì)有色化合物和復(fù)雜成分如中藥和天然提取物的篩選。固定化酶的活性比未固定的腺苷同型半胱氨酸水解酶的活性略降低，但較普通的酶穩(wěn)定，可重復(fù)利用。 |
| 國(guó)際公布 |
