| 公開(公告)號(hào) | CN1260247C |
| 公開(公告)日 | 2006.06.21 |
| 申請(qǐng)(專利)號(hào) | CN200310108421.8 |
| 申請(qǐng)日期 | 2003.11.05 |
| 專利名稱 | 一種用于重組tPA衍生物的大規(guī)模包涵體復(fù)性純化技術(shù) |
| 主分類號(hào) | C07K1/113(2006.01)I |
| 分類號(hào) | C07K1/113(2006.01)I;C12N9/72(2006.01)I;C12N9/00(2006.01)I |
| 分案原申請(qǐng)?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(qǐng)(專利權(quán))人 | 上海中科伍佰豪生物工程有限公司 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 張 毅;陸堅(jiān)峰;楊勝利;褚仲梅;劉 成;屈賢銘 |
| 地址 | 200233上海市漕寶路500號(hào) |
| 頒證日 | |
| 國(guó)際申請(qǐng) | |
| 進(jìn)入國(guó)家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 |
| 代理人 | 徐 迅 |
| 國(guó)省代碼 | 上海;31 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種蛋白質(zhì)復(fù)性方法，其特征在于，包括步驟：(a)將目標(biāo)蛋白質(zhì)的包涵體溶解，離心獲得溶解有包涵體蛋白質(zhì)的上清液；(b)用第一復(fù)性液稀釋上清液，形成目標(biāo)蛋白質(zhì)的濃度為100-1000微克/毫升的第一稀釋溶液，其中，第一復(fù)性液含3-7M選自尿素或鹽酸胍的變性劑和緩沖液，pH7.5-9.0，并且第一復(fù)性液中所含的氧化型谷胱甘肽及還原型谷胱甘肽與目標(biāo)蛋白質(zhì)之比為4-10mmol谷胱甘肽：0.1-1mg目標(biāo)蛋白，且還原型谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽的摩爾比為4-6：0.8-2；(c)在20-28℃下，放置第一稀釋溶液16-24小時(shí)；(d)用第二復(fù)性液稀釋第一稀釋溶液，形成目標(biāo)蛋白質(zhì)的濃度為10-100微克/毫升的第二稀釋溶液，其中，第二復(fù)性液含0.1-2.5M尿素和緩沖液，pH7.5-9.0：(e)在20-28℃下，放置第二稀釋溶液16-24小時(shí)；(f)過(guò)濾第二稀釋溶液，將濾液體積超濾濃縮為原體積的1/8-1/40，獲得第一濃縮濾液；(g)過(guò)濾第一濃縮濾液，然后將濾液稀釋于3-7倍體積的pH調(diào)節(jié)緩沖液中，所述的pH調(diào)節(jié)緩沖液含有10-100mM醋酸堿土金屬鹽或醋酸銨，pH4.0-5.5；(h)過(guò)濾步驟(g)的稀釋溶液，將溶液體積超濾濃縮為原體積的1/3-1/10，獲得含有復(fù)性的目標(biāo)蛋白的第二濃縮濾液。 |
| 摘要 | 本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)復(fù)性方法，包括步驟：(a)將目標(biāo)蛋白質(zhì)的包涵體溶解，離心獲得溶解有包涵體蛋白質(zhì)的上清液；(b)用第一復(fù)性液稀釋，其中第一復(fù)性液含氧化還原對(duì)；(c)放置一段時(shí)間；(d)用第二復(fù)性液稀釋，第二復(fù)性液不含氧化還原對(duì)；(e)放置一段時(shí)間；(f)過(guò)濾、濃縮，獲得第一濃縮濾液；(g)過(guò)濾，然后將濾液稀釋于pH調(diào)節(jié)緩沖液中，調(diào)節(jié)pH至4.0-5.5；(h)過(guò)濾步驟(g)的稀釋溶液，濃縮獲得含有復(fù)性的目標(biāo)蛋白的第二濃縮濾液。本發(fā)明復(fù)性方法成本低，用于大腸桿菌表達(dá)的重組tPA或其衍生物的低成本的重組蛋白質(zhì)。 |
| 國(guó)際公布 |
