| 公開(公告)號(hào) | CN1253584C |
| 公開(公告)日 | 2006.04.26 |
| 申請(qǐng)(專利)號(hào) | CN02131070.X |
| 申請(qǐng)日期 | 2002.09.28 |
| 專利名稱 | 通過檢測(cè)人類T細(xì)胞受體TCR基因在治療前后的變化來評(píng)價(jià)治療HIV藥物療效的方法 |
| 主分類號(hào) | C12Q1/68(2006.01)I |
| 分類號(hào) | C12Q1/68(2006.01)I |
| 分案原申請(qǐng)?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(qǐng)(專利權(quán))人 | 北京佰仁思生物工程有限責(zé)任公司 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 寇忠琛 |
| 地址 | 102200北京市海淀區(qū)中關(guān)村科技園區(qū)昌平園星火街6號(hào) |
| 頒證日 | |
| 國際申請(qǐng) | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 北京匯澤知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 |
| 代理人 | 張若華 |
| 國省代碼 | 北京;11 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 通過檢測(cè)人類T細(xì)胞受體TCR基因在治療前后的變化來評(píng)價(jià)治療HIV藥物療效的方法，其步驟為： a.血樣經(jīng)采集分離后，得到外周血單個(gè)核細(xì)胞，再進(jìn)一步分離出CD4或CD8T細(xì)胞； b.分離和提純出T細(xì)胞的mRNA后，通過mRNA合成得到cDNA； c.在極其靠近CDR3區(qū)段V基因區(qū)設(shè)計(jì)22個(gè)內(nèi)側(cè)Vβ基因引物和一個(gè)內(nèi)側(cè)Cβ基因引物，Cβ基因引物的5′端插入七個(gè)非模板堿基GTTTCTT，Cβ基因引物采用高靈敏度的熒光標(biāo)記，所述Vβ基因引物和Cβ基因引物如下： VβoutPCR引物： Vβ1out5′GGAGTCACACAAACCCCAAAGCACCTG3′， Vβ2out5′GTTATCTGTAAGAGTGGAACC3′， Vβ3out5′CTCGTAGATGTGAAAGTAACCCAGAG3′， Vβ4out5′GATAGCCAAGTCACCATGATGTTC3′， Vβ5.1out5′GTCGATTCTCAGGGCGCCAGTTCTC3′， Vβ6out5′GAGTCTCCCAGAACCCCAGACACAAG3′， Vβ7out5′GGTCATGGGAATGACAAATAAGAAG3′， Vβ8out5′CGATAGATGATTCAGGGATGCCCGAG3′， Vβ9out5′GACAAGTCCATTAAATGTGAAC3′， Vβ11out5′CTGACATCTACCAGACCCCAAGATAC3′， Vβ12out5′GATACTGACAAAGGAGAAGTC3′， Vβ13out5′CAAGACCCAGGCATGGGGCTGAAG3′， Vβ14out5′GGGAGATGTTCCTGAAGGGTAC3′， Vβ15out5′CTCGACAGGCACAGGCTAAATTC3′， Vβ16out5′GATTCTTAGCTGAAAGGACTGGAGG3′， Vβ17out5′GAAGGGTACAGCGTCTCTCGGGAGAAG3′， Vβ18out5′GCCGGCGTCATGCAGAACCCAAGAC3′， Vβ20out5′CTCTCAGCCTCCAGACCCCAG3′， Vβ21out5′GCCTGTGGCTTTTTGGTGCAATC3′， Vβ22out5′CACACAGATGGGACAGGAAG3′， Vβ23out5′CCCTGATCGATTCTCAGCTCAAC3′， Vβ24out5′CGGCCGAACACTTCTTTCTG3′； VβinPCR引物： Vβ1in5′CTAAACCTGAGCTCTCTGG3′， Vβ2in5′GCAGCTTCTACATCTGCAG3′， Vβ3in5′GATTCTGGAGTCCGCCAG3′， Vβ4in5′CAGCAGCATATATCTCTGC3′， Vβ5.1in5′GACTCGGCCCTTTATCTTTG3′， Vβ6in5′GGAGATCCAGCGCACAGAG3′， Vβ7in5′CCTGAATGCCCCAACAGCTC3′， Vβ8in5′CCAGCCCTCAGAACCCAGG3′， Vβ9in5′CTGGAGCTTGGTGACTCTGTG3′， Vβ11in5′CCTGGAGTCTGCCAGGCC3′， Vβ12in5′CTCACTCTGGAGTCGCTAC3′， Vβ13in5′GAGGATTTCCCGCTCAGGC3′， Vβ14in5′GAGAAGAGGAATTTCAATTTCC3′， Vβ15in5′GAGTCTGCCATCCCCAAC3′， Vβ16in5′CAGAACTGGAGGATTCTGG3′， Vβ17in5′CGGCCCAAAAGAACCCGACAGC3′， Vβ18in5′GTGCGAGGAGATTCGGCAG3′， Vβ20in5′CAGGACCGGCAGTTCATCTTC3′， Vβ21in5′CCTGCAGAGCTTGGGGAC3′， Vβ22in5′CACTCTGAAGATCCGGTCC3′， Vβ23in5′GAGCTCCTTGGAGCTGGGG3′， Vβ24in5′CATCCGCTCACCAGGCCTGGG3′； Cβout5′CAGGCCTCGGCGCTGACGATCTGGGTGAC3′， 3′Cβin*5′GTTTCTTGATCTCTGCTTCTGATGGCTCAAAC3′， *6-FAMlabelling； d.將設(shè)計(jì)的引物和由mRNA合成的cDNA通過兩次PCR反應(yīng)來擴(kuò)增cDNA，所述兩次PCR反應(yīng)的條件為： 第一次反應(yīng)：變性95℃，45秒；復(fù)性60℃，45秒；延伸72℃，45秒，34個(gè)循環(huán)，72℃10分鐘；反應(yīng)體系為： 5′引物10pmol1μl， 3′引物10pmol1μl， dNTPs10mM1μl， 10×反應(yīng)緩沖液2.5μl， 三蒸水18.75μl， cDNA0.5μl， TaqDNA聚合酶0.25μl； 第二次反應(yīng)：變性95℃，30秒；復(fù)性60℃，30秒；延伸72℃，30秒，15個(gè)循環(huán)，72℃10分鐘；反應(yīng)體系為： 5′引物10pmol0.5μl， 3′引物10pmol0.5μl， dNTPs10mM1μl， 10×反應(yīng)緩沖液2.5μl， 三蒸水19.75μl， 第一次PCR產(chǎn)物0.5μl， TaqDNA聚合酶0.25μl； 其中10×反應(yīng)緩沖液的組分如下： Tris-HClpH8.3300mM， MgCl250mM， KCl25mM， 明膠0.01％； e.將經(jīng)過兩次PCR反應(yīng)擴(kuò)增并被熒光標(biāo)記的T細(xì)胞受體基因，與甲酰胺混合后94℃變性，將變性產(chǎn)物置于含6％丙烯酰胺的測(cè)序凝膠中，在DNA測(cè)序機(jī)上運(yùn)行，得到的數(shù)據(jù)用ABIPRISMGeneScan分析軟件進(jìn)行分析和量化，通過比較HIV病毒感染者治療前后CDR3基因圖譜的變化，得出藥物療效的評(píng)價(jià)結(jié)果。 |
| 摘要 | 發(fā)明提供一種通過設(shè)計(jì)的特定引物來完成PCR反應(yīng)，放大感染HIV病毒的患者的T細(xì)胞受體TCR基因在接受藥物治療前后的變化，進(jìn)而評(píng)價(jià)藥物的療效的方法，本發(fā)明提供的技術(shù)不但填補(bǔ)了技術(shù)上的空白而且具有靈敏度高，準(zhǔn)確性好的優(yōu)點(diǎn)。 |
| 國際公布 |
