公開(公告)號
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CN1944645A
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公開(公告)日
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2007.04.11
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申請(專利)號
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CN200610102042.1
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申請日期
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2006.10.17
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專利名稱
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利用乳腺生物反應器制備重組人的抗凝血酶Ⅲ蛋白的方法
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主分類號
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C12N15/09(2006.01)I
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分類號
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C12N15/09(2006.01)I;C12N15/85(2006.01)I;C12N15/12(2006.01)I;C12N5/06(2006.01)I;C12N15/06(2006.01)I;A61K38/17(2006.01)I
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分案原申請?zhí)? |
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優(yōu)先權(quán)
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申請(專利權(quán))人
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青島森淼生物技術(shù)研究所
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發(fā)明(設計)人
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袁三平;鄒賢剛;鮮 建
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地址
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255068山東省青島市株州路177號惠特工業(yè)園A區(qū)5號樓2層
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頒證日
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國際申請
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進入國家日期
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專利代理機構(gòu)
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青島發(fā)思特專利商標代理有限公司
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代理人
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蔡紹強
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國省代碼
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山東;37
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主權(quán)項
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一種利用乳腺生物反應器制備重組人的抗凝血酶III蛋白的方法,其特征是該方法包括下述步驟: (1)選用哺乳動物的乳蛋白基因為轉(zhuǎn)基因的調(diào)控區(qū)和表達框架,在乳蛋白基因的表達框架上建立唯一的酶切位點和乳蛋白分泌序列,然后將重組人的抗凝血酶III蛋白基因和腸激酶蛋白質(zhì)酶切序列連接在乳蛋白基因的表達框架上,轉(zhuǎn)基因載體的末端再連接一個篩選基因; (2)所構(gòu)建的載體經(jīng)DNA序列分析,確定人的抗凝血酶III蛋白基因與乳蛋白基因的DNA序列,并與乳蛋白基因本身的表達和功能基因的氨基酸組成一致; (3)用電穿孔或脂質(zhì)體誘導的方法,將人的抗凝血酶III蛋白基因表達載體,轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的動物的體細胞中; (4)在培養(yǎng)基中對細胞株進行篩選,獲得篩選后的陽性細胞株;一部分細胞冷凍保存,一部分細胞用于制備DNA; (5)陽性細胞株的DNA,經(jīng)PCR和Southern雜交分析,確定含有人的抗凝血酶III蛋白基因的細胞株; (6)轉(zhuǎn)基因的細胞株的細胞移入山羊成熟的去核卵母細胞的卵周隙內(nèi),然后使供核細胞和去核卵母細胞融合; (7)將克隆胚胎移植到寄母羊的輸卵管中,經(jīng)妊娠獲得轉(zhuǎn)基因克隆羊; (8)檢測轉(zhuǎn)人的抗凝血酶III蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動物的乳汁中的重組人的抗凝血酶III蛋白含量; (9)含有人的抗凝血酶III蛋白的轉(zhuǎn)基因動物的乳汁中的重組人的抗凝血酶III蛋白的提純; (10)純化的重組人的抗凝血酶III蛋白的動物試驗; (11)重組人的抗凝血酶III蛋白在人體上的應用。
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摘要
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本發(fā)明涉及一種利用乳腺生物反應器制備重組人的抗凝血酶III蛋白的方法。其包括:選哺乳動物的乳蛋白基因為轉(zhuǎn)基因的調(diào)控區(qū)和表達框架,在框架上建立一個唯一的酶切位點,再將人AT-III蛋白基因功能部分,乳蛋白分泌序列和腸激酶蛋白質(zhì)酶切序列基因,連接在表達框架上,載體的末端再連接一個篩選基因;將表達載體轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的動物體細胞中;獲得含有人的AT-III蛋白基因的細胞株;轉(zhuǎn)基因細胞株移入山羊成熟的去核卵母細胞內(nèi),使供核細胞和去核卵母細胞融合;克隆胚胎移植到寄母羊的輸卵管中,經(jīng)妊娠獲得轉(zhuǎn)基因克隆羊;檢測轉(zhuǎn)基因動物乳汁中的人AT-III蛋白的含量和活性、提純;經(jīng)動物試驗和人體試驗;重組人AT-III蛋白在人體上的應用。
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國際公布
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