醫(yī)學(xué)免費(fèi)論文:pET15b�瞃ARA�睧GFP原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及融合蛋白YARA�睧GFP的表達(dá)與純化

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑:限制性核酸內(nèi)切酶XhoⅠ、NdeⅠ、XbaⅠ和T DNA連接酶購(gòu)自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司;編碼YARA的兩條寡核苷酸鏈由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成，序列為正義鏈：5′�睺ATGTATGCCCGCGCGGCGGCGCGACAAGCGCGAG CCC��3′(38 bp)，反義鏈：5′�睺CGAGGGCTCGCGCTTGTCGCGCCGCCGCGCGGGCATACA��3′(40 bp)，100 bp DNA Ladder購(gòu)自北京華美生物工程有限公司;IPTG(isopropyl β�睤�瞭hiogalactoside)購(gòu)自美國(guó)Promega公司;Ni2+�睳TA 樹(shù)脂填料購(gòu)自美國(guó)QIAGEN公司;預(yù)染蛋白質(zhì)相對(duì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自江蘇碧云天有限公司;兔抗His�瞭ag多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司;Western blot試劑盒購(gòu)自美國(guó)KPL公司;ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自Amersham Pharmacia Biotech公司。

1.1.2 質(zhì)粒與菌株:pET15b,E.coli BL21(DE3)購(gòu)自美國(guó)Novagen公司，E.coli DH5α和pET15b�睵EP��1�睧GFP原核表達(dá)載體由鄖陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所提供。

1.1.3 主要儀器:投射式紫外分析儀(EF��90A，上海)，凝膠成像系統(tǒng)(Touching 955 gel document system，上海)，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Hettich，Universal 32 R，德國(guó))，超聲波細(xì)胞粉碎儀(JY��98��3D，寧波)，超速冷凍離心機(jī)(Hitachi，Himac CP80MX，日本)，核酸蛋白檢測(cè)儀(HD��2004B，上海)，恒流泵(HL2，上海)，紫外分光光度計(jì)(Cecil 2041，英國(guó))醫(yī).學(xué).全.在.線(xiàn)quanxiangyun.cn。

1.2 方法

1.2.1 pET15b�瞃ARA�睧GFP的構(gòu)建:將pET15b�睵EP��1�睧GFP分別用XhoⅠ、NdeⅠ酶切，使之去掉編碼PEP��1的DNA序列，酶切產(chǎn)物用1%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳，然后在紫外燈下切取含酶切大片段的凝膠，65 ℃水浴10 min融化凝膠，用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，沉淀用10 μL消毒三蒸水溶解。將編碼YARA的兩條寡核苷酸鏈等摩爾混合后煮沸變性，再逐漸降溫至室溫復(fù)性，形成兩端分別為XhoⅠ和NdeⅠ粘性末端的雙鏈DNA，然后與線(xiàn)性化的酶切大片段用T4 DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α大腸桿菌，擴(kuò)增后提取重組質(zhì)粒并用XhoⅠ和XbaⅠ酶切鑒定，若出現(xiàn)137 bp片段，說(shuō)明編碼YARA的DNA片段插入到酶切后的質(zhì)粒中，成功插入了編碼YARA序列的質(zhì)粒命名為pET15b�瞃ARA�睧GFP(圖1)。將重組正確的質(zhì)粒送北京華大中生科技有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。

1.2.2 pET15b�瞃ARA�睧GFP轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)和YARA�睧GFP融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá):從-80 ℃超低溫冰箱取出100 μL E.coli BL21(DE3)，取1 μL pET15b�瞃ARA�睧GFP質(zhì)粒加入菌液中，輕彈管壁，使其均勻分布，置冰上30 min，42 ℃水浴中熱休克90 s后，迅速置冰浴冷卻2 min。取1 mL SOC培養(yǎng)基與轉(zhuǎn)化菌液混勻后加入10 mL離心管，將其置37 ℃水浴搖床中振搖(150 r/min)1 h。轉(zhuǎn)化的菌液鋪于含100 μg/mL Ampicillin的LB平板上，置37 ℃細(xì)菌培養(yǎng)箱中過(guò)夜，挑取單克隆接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振搖培養(yǎng)過(guò)夜，然后用新鮮培養(yǎng)基按1∶50比例稀釋?zhuān)瑪U(kuò)大培養(yǎng)至OD600≈0.8時(shí)加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG，30 ℃培養(yǎng)12 h以誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。4 ℃、5 000 r/min離心5 min，收集細(xì)菌沉淀，1×PBS漂洗3次，加6倍柱體積的結(jié)合緩沖液(5 mmol/L Imidazole，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris·HCl，pH 7.9)重懸菌體。然后冰浴超聲破菌(520 W，30 min)，將菌液置超速冷凍離心機(jī)中20 000 r/min離心10 min，則融合蛋白以天然、可溶的形式存在于上清中。

1.2.3 YARA�睧GFP融合蛋白的純化:pET15b作為載體所表達(dá)的基因工程重組蛋白在其N(xiāo)端帶有一個(gè)由6個(gè)組氨酸組成的“標(biāo)簽”(His�瞭ag)，可用Ni2+�睳TA樹(shù)脂進(jìn)行親和層析純化。收集超離后的上清，將其轉(zhuǎn)入裝有Ni2+�睳TA樹(shù)脂的層析柱中，靜置4 h，以便6個(gè)組氨酸標(biāo)簽與填料中Ni2+充分結(jié)合。用10倍柱體積的漂洗緩沖液(30 mmol/L Imidazole，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris·HCl，pH 7.9)過(guò)柱以洗去未結(jié)合的雜蛋白，然后用5倍柱體積的洗脫緩沖液(500 mmol/L Imidazole，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris·HCl，pH 7.9)洗柱并收集洗脫下來(lái)的目的蛋白YARA�睧GFP。目的蛋白用生物半透膜透析48 h以充分脫鹽(透析液為 pH 7.4的 PBS)，透析后的融合蛋白用0.45 μm的濾膜除菌后，用1.5 mL Eppendorf 管分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/P>

1.2.4 YARA�睧GFP融合蛋白的定性：制備12%分離膠和5%濃縮膠，分別取含有目的蛋白的細(xì)菌裂解上清(純化前)和收集的峰值洗脫液(純化后)行SDS�睵AGE 電泳，凝膠用考馬斯亮藍(lán)R��250 染色40 min后，用SDS�睵AGE凝膠脫色液放在水平搖床上振搖脫色至本底無(wú)色為止。融合蛋白經(jīng)SDS�睵AGE分離后行Western blot以進(jìn)一步證實(shí)純化產(chǎn)物。將凝膠電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，加10 mL封閉液封閉2 h阻斷非特異性結(jié)合部位，加入1∶1 000稀釋的一抗(兔抗組氨酸多克隆抗體)10 μL， 室溫振搖孵育過(guò)夜。Western blot漂洗液漂洗4次，每次8 min。加10 mL封閉液及按1∶1 000 稀釋的羊抗兔二抗10 μL，水平搖床孵育2 h 后漂洗4次，每次8 min。用三蒸水沖洗一遍硝酸纖維素膜，放入干凈的平皿中加入1 mL化學(xué)發(fā)光劑ECL，置入暗室用X光膠片曝光，然后顯影，定影。醫(yī).學(xué).全.在.線(xiàn)quanxiangyun.cn

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