SphK1突變抑制高糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞纖維連接蛋白過(guò)度表達(dá)的研究
[提要] 目的 研究鞘氨醇激酶-1(SphK1)突變是否抑制了高糖培養(yǎng)的系膜細(xì)胞中纖維連接蛋白(FN)的過(guò)度表達(dá)。 方法 采用Western blot檢測(cè)FN的表達(dá)。 結(jié)果 系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)染了SphK1突變質(zhì)粒后可消除高糖誘導(dǎo)的FN上調(diào)效應(yīng)。 結(jié)論 本研究結(jié)果證明了SphK1在高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞FN表達(dá)過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。
[關(guān)鍵詞] SphK1;纖維連接蛋白;系膜細(xì)胞
[中圖分類(lèi)號(hào)] R587.2;R692.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701(2013)15-0010-02
系膜細(xì)胞(Mesangial cell,MC)是腎小球的主要功能細(xì)胞,無(wú)論在腎臟的生理功能還是病理變化中均發(fā)揮著重要的作用;現(xiàn)已認(rèn)為MC主要參與了糖尿病腎病腎小球硬化損傷過(guò) 程。FN是由系膜細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分之一,在糖尿病狀態(tài)下,腎小球系膜細(xì)胞FN等細(xì)胞外基質(zhì)的積聚,導(dǎo)致腎小球硬化、促進(jìn)糖尿病腎病的病變進(jìn) 程[1]。鞘氨醇激酶(sphingosine kinase, SphK)是催化S1P生成的關(guān)鍵限速酶[2]。我們前期研究表明:用四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病小鼠模型12周后醫(yī)學(xué)全在線quanxiangyun.cn,模型組小鼠在腎小球結(jié)構(gòu)異常、腎功能降低的基 礎(chǔ)上,SphK1蛋白表達(dá)與活性較正常組相比明顯升高;免疫組化結(jié)果顯示,小鼠腎組織的SphK1主要表達(dá)于腎小球細(xì)胞,而模型組與正常組相比顯著升高 [3],提示在糖尿病狀態(tài)下SphK1的激活可能參與了糖尿病腎病的病變進(jìn)程。本研究重點(diǎn)觀察SphK1對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)主要成分-FN的調(diào)節(jié)作用,探討糖尿 病狀態(tài)下高糖激活的SphK1對(duì)系膜細(xì)胞FN生成的具體分子機(jī)制。
1 材料與方法
1.1 腎小球系膜細(xì)胞原代培養(yǎng)
采用逐級(jí)過(guò)篩法從SD大鼠的腎臟分離得到腎小球,用完全培養(yǎng)基(DMEM+20%胎牛血清+胰島素 0.66 U/mL+ 2 mM谷氨酰胺+青霉素100 U/mL+鏈霉素100 μg/mL)約2滴,用吸管重懸腎小球,加入塑料培養(yǎng)瓶中,向各方向輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶,使含腎小球的細(xì)胞懸液均勻分布于瓶底,待細(xì)胞懸液近干時(shí),然后迅速倒 轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶(使培養(yǎng)面朝上),加入約5 mL完全培養(yǎng)液,放入CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng),4 h后,再輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)。待原代腎小球系膜細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)瓶底后,吸棄培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基,用PBS沖洗培養(yǎng)瓶。加入0.25%胰蛋白酶消化約1~3 min,鏡檢發(fā)現(xiàn)細(xì)胞突起回縮,細(xì)胞間隙增大,或輕輕振動(dòng)后絕大部分細(xì)胞懸浮、漂移,立即加入含血清培養(yǎng)基終止消化,于1000 rpm離心5 min,傳代培養(yǎng)基懸浮GMC至所需濃度,按1∶2比例傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)采用第3代到第15代之間的細(xì)胞。
1.2 質(zhì)粒和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
空載體(Vector),突變型質(zhì)粒(SphKG82D)由澳大利亞Dr. Pu Xia贈(zèng)送。按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)采用Lipofectamine 2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染系膜細(xì)胞72 h后收集細(xì)胞。
1.3 Western blot
細(xì)胞經(jīng)裂解提取蛋白后,經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后,轉(zhuǎn)膜至PVDF。采用5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h,將一抗、二抗孵育后,采用增強(qiáng)型的化學(xué)發(fā)光液檢測(cè)條帶信號(hào)。膜重孵鼠單抗 α-tubulin作為內(nèi)參對(duì)照。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
數(shù)值采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析結(jié)合Bonferroni校正分析多組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
SphK1突變抑制了高糖誘導(dǎo)MC的FN表達(dá)醫(yī)學(xué)全在線quanxiangyun.cn,MC分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒Vector和突變型質(zhì)粒SphKG82D。結(jié)果表明,高糖能明顯上調(diào)FN 的表達(dá);轉(zhuǎn)染了SphKG82D質(zhì)粒后顯著抑制了高糖誘導(dǎo)的FN表達(dá),而轉(zhuǎn)染Vector質(zhì)粒無(wú)此效應(yīng),證明SphK1參與了高糖誘導(dǎo)的FN表達(dá)。
3 討論
系膜細(xì)胞是腎臟的主要功能細(xì)胞,糖尿病狀態(tài)下,腎小球系膜細(xì)胞FN等細(xì)胞外基質(zhì)成分的積聚是導(dǎo)致腎小球硬化、促進(jìn)糖尿病腎病病變形成的重要特 征。因此,我們采用體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討高糖環(huán)境下腎小球系膜細(xì)胞S1P信號(hào)通路的激活與細(xì)胞外基質(zhì)成分FN生成的關(guān)聯(lián)性,以明確高糖激活的S1P信號(hào)通路 參與糖尿病腎病病理進(jìn)程的作用機(jī)制。
SphK1是催化S1P生成的關(guān)鍵酶[2,4,5]。研究表明:長(zhǎng)期高血糖、AGEs、氧化應(yīng)激等可激活SphK1,進(jìn)而導(dǎo)致S1P的生成增 加[6-9]。以往研究表明S1P在腎小球系膜疾病中起著重要作用[10-12]。外源性S1P可顯著促進(jìn)GMC增殖[10-12],導(dǎo)致腎臟疾病的發(fā) 生。
近年來(lái),SphK1-S1P信號(hào)通路與包括糖尿病腎病在內(nèi)的糖尿病性血管并發(fā)癥的關(guān)系日益受到關(guān)注,成為相關(guān)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。慢性高血糖現(xiàn)被 認(rèn)為是糖尿病微血管及大血管病變的主要致病因素;血管內(nèi)皮損傷是導(dǎo)致糖尿病慢性血管病變的起始環(huán)節(jié)[13]。研究發(fā)現(xiàn),高血糖能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞SphK1 的活化,參與了內(nèi)皮損傷過(guò)程。同樣在高糖培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中SphK活性也有顯著增加,采用siRNA技術(shù)證明高糖主要激活SphK16。高血糖狀態(tài)下形成 的AGEs現(xiàn)已證明是外周微血管病變的主要致病因素之一,導(dǎo)致糖尿病腎病和終末期腎衰竭。Geoffroy等用AGEs處理GMC,發(fā)現(xiàn)當(dāng)AGEs低濃度 時(shí)醫(yī)學(xué)全在線quanxiangyun.cn,神經(jīng)酰胺酶和鞘氨醇激酶活性明顯升高,導(dǎo)致S1P積聚,誘使GMC增殖。Geoffroy隨后觀察了STZ誘導(dǎo)小鼠4 d后腎臟中SphK1活性和S1P含量的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著腎小球系膜細(xì)胞輕度增殖,腎臟中SphK1活性和S1P均顯著增加,提示SphK1-S1P信 號(hào)通路可能參與了糖尿病腎小球增殖過(guò)程[8,9]。
本研究發(fā)現(xiàn):在正常糖培養(yǎng)情況下,MC經(jīng)過(guò)高糖培養(yǎng)后,F(xiàn)N的表達(dá)顯著升高,而轉(zhuǎn)染突變型質(zhì)粒SphKG82D的MC,幾乎完全抵消高糖誘導(dǎo) 的MC中FN上調(diào)效應(yīng),提示高糖誘導(dǎo)的FN過(guò)度表達(dá)需要SphK1的參與調(diào)節(jié),為探尋將SphK1-S1P信號(hào)通路作為抗糖尿病腎病的可能作用靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。