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4 討論
聚集是重組抗體藥物面臨的一大難題。為保證生產(chǎn)過程中的穩(wěn)定性以及適應臨床應用的要求，對于抗體聚集的性質(zhì)、規(guī)律和發(fā)生原因的研究是非常必要的。以此為基礎，對聚集的改善可通過對抗體分子本身的改造或保存條件的優(yōu)化來實現(xiàn)。
目前對于聚集現(xiàn)象的鑒定有多種方法，本文聯(lián)用HPSE 和DLS 兩種方法。HPSE具有用量少、靈敏度高、對不同聚集組分的比例定量精確等優(yōu)點，但是上柱前高濃度樣品經(jīng)常要進行稀釋處理，對于高濃度狀態(tài)下樣品的檢測有一定誤差。DLS 的優(yōu)點是樣品無需稀釋，可以較為直觀地從粒徑大小來說明蛋白質(zhì)的聚集情況，適合分析高濃度高分子量蛋白，但是不能精確將聚集程度定量。因此同時使用兩種方法可以更全面的對聚集情況進行分析。
本實驗中DLS 和HPSE 結(jié)果都證實聚集的存在，但DLS 對聚集程度的判定比HPSE 低，可能與DLS 本身精確度以及在操作時溫度設置較高（20)有關，實驗表明溫度升高時會使抗體有所解聚。SDS-PAGE 和間接ELISA 實驗證明hA21 在給定溶液中的聚集是通過非共價相互作用形成的，不同聚集形式都保留有抗原結(jié)合活性。這種非共價的聚集具有可逆性，可受溶液環(huán)境的影響，提示我們可通過優(yōu)化保存條件對聚集加以改善：實驗表明在接近中性的條件下，隨著pH 值的升高聚集比例增加（數(shù)據(jù)略)，可能和接近抗體等電點有關（pI 約為8.75)，因此為了減少聚集，我們一般采取中性偏酸的緩沖液保存；本研究中我們以pH值為5.5 的醋酸鈉緩沖液為代表，發(fā)現(xiàn)溫度升高使抗體有所解聚，可能是由于此時疏水作用增強促進抗體分子內(nèi)折疊，從而減少蛋白間相互作用引起的；甘露醇在低溫下對抗體解聚作用不明顯，但高溫時的解聚作用影響明顯，其機理有待于進一步分析。在這幾種不同的聚集程度下單體比例多時抗體結(jié)合活性增強，提示聚集部位可能位于抗體可變區(qū)。盡管聚集程度有所差別，但抗體的天然構(gòu)象基本維持不變，這也是抗體保持活性的基礎。
抗體酶解片段的分析進一步顯示hA21 的聚集可能主要是由可變區(qū)（單鏈抗體)的相互作用引起的。單鏈抗體是通過一段連接肽（linker)將抗體重鏈（VH)和輕鏈（VL)共價相連，VH 和VL 之間通過疏水作用折疊成抗原結(jié)合區(qū)。有文獻報道單鏈抗體分子間的相互作用受linker 長短、VH 和VL 的氨基酸組成以及溶液環(huán)境影響，但一般認為連接肽大于15 個氨基酸的單鏈抗體主要以單體形式存在。hA21 的單鏈抗體的linker 具有20 個氨基酸仍有聚集趨勢，可能與其本身獨特的性質(zhì)有關，本實驗室已解析出hA21 單鏈抗體的晶體結(jié)構(gòu) ，將結(jié)合晶體結(jié)構(gòu)進一步分析醫(yī).學.全.在.線網(wǎng)站提供。
嵌合抗體分子量僅為全抗體的三分之二，具有免疫原性低和穿透性好的特點，但是這類抗體的聚集特性目前所知甚少。本實驗對hA21 抗體的可逆聚集現(xiàn)象進行了初步研究，探討了影響聚集的因素，同時分析抗體的聚集部位，為今后抗體進一步改造提供了思路和依據(jù)。
