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高濃度甲羥孕酮抑制內(nèi)皮祖細胞的增殖
1. 引言
血管生成是腫瘤發(fā)展的重要階段，新生血管為腫瘤提供獨立的血管支持，促進腫瘤的發(fā)展，抑制腫瘤的血管生成是抗腫瘤的新方向。研究表明EPCs參與腫瘤的血管生成，促進腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。特異性的去除EPCs明顯減少血管生成，使原發(fā)和繼發(fā)腫瘤體積縮小。
因此，抑制EPCs的功能可以抑制腫瘤的生長。甲羥孕酮有抑制腫瘤細胞和血管生成的作用，但具體機制仍不清楚。本論文研究了MPA對EPCs生長的作用，以期了解MPA在抗腫瘤血管生成中的作用機制。
2. 材料與方法
2.1 實驗動物
雌性成年Beagle犬，由四川大學華西醫(yī)院動物實驗中心提供。
2.2 主要試劑
EBM-2培養(yǎng)液(Lonza)；MPA、淋巴細胞分離液、MTT均購自Sigma；兔抗人PR抗體(SantaCruz)。
2.3 EPCs的分離培養(yǎng)
無菌抽取犬骨髓5ml，肝素抗凝，置于淋巴細胞分離液(1.077)上，密度梯度離心(500g，25min)。吸出單個核細胞層，PBS洗滌兩次(250g，10min)，以EBM-2重懸細胞，接種于FN預包被的培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)。4d后首次換液，以后每3天換一次液，待細胞長至90％匯合后傳代。實驗采用第三至第五代細胞。
2.4 免疫細胞化學
細胞爬片經(jīng)PBS漂洗后，用4%多聚甲醛固定15min，正常血清37℃封閉30min，吸去多余血清；分別滴加兔抗人PR多克隆抗體(1:100稀釋)，4℃過夜；生物素化羊抗兔IgG，37℃孵育30min后，ABC法顯色；蘇木素復染、封片，光鏡下觀察。以PBS為陰性對照。
2.5 細胞增殖實驗
取對數(shù)生長期細胞加入96孔(2.5×103/孔)板中，貼壁4h后，為避免EBM-2培養(yǎng)基中的生長因子干擾實驗，換為含不同濃度MPA的M199(10%胎牛血清)培養(yǎng)液，以下實驗均同樣處理。MPA終濃度分別為1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8、0mol/L，重復3孔。MTT法測定吸光度值(OD)，連續(xù)7天，繪制EPCs的生長曲線。
2.6 MPA抑制率測定
采用1×10-3、7.5×10-4、5×10-4、2.5×10-4、1×10-4、7.5×10-5、5×10-5、2.5×10-5、1×10-5、0mol/L的MPA作用于EPCs48h后，計算其抑制率。
抑制率=(1-實驗組OD/對照組OD)×100%并用SPSS軟件計算半數(shù)抑制率IC50。
2.7 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學方法計量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示，多組計量數(shù)據(jù)均值的差異采用單因素方差分析(ANOVA)。統(tǒng)計學分析采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
