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| 實(shí)驗(yàn)二十三 血清γ-球蛋白的分離純化與鑒定 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p> 電泳、層析、離心及分光光度分析等技術(shù)方法常常廣泛應(yīng)用于生物樣品中各種生物分子和分離純化和鑒定。蛋白質(zhì)的分離和純化是研究蛋白質(zhì)化學(xué)及其生物學(xué)功能的前提和基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)采用離心、層析和電泳等技術(shù)方法以分離純化和鑒定血清中的γ-球蛋白，涉及到生物化學(xué)和相關(guān)學(xué)科的多種技術(shù)的配套應(yīng)用，從而達(dá)到訓(xùn)練學(xué)生綜合性運(yùn)用及掌握這些基本生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)的目的。本實(shí)驗(yàn)還涉及到質(zhì)量控制和效益分析，使培養(yǎng)貼近實(shí)用、強(qiáng)化能力。 實(shí)驗(yàn)方案一 【實(shí)驗(yàn)原理】 血清中蛋白質(zhì)按電泳法一般可分為五類：清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白，其中γ-球蛋白含量約占16％，100 mL血清中約含1.2 g左右。不同種類的蛋白質(zhì)其分子量、溶解度，以及在一定條件下帶電荷的情況有所不同，可根據(jù)這些性質(zhì)的差別，分離及提純蛋白質(zhì)。 首先利用清蛋白和球蛋白在高濃度中性鹽溶液中(常用硫酸銨)溶解度的差異而進(jìn)行沉淀分離，此為鹽析法。半飽和硫酸銨溶液可使球蛋白沉淀析出，清蛋白則仍溶解在溶液中，經(jīng)離心分離，沉淀部分即為含有γ-球蛋白的粗制品。 用鹽析法分離而得的蛋白質(zhì)中含有大量的中性鹽，會(huì)妨礙蛋白質(zhì)進(jìn)一步純化，因此首先必須去除。常用的方法有透析法、凝膠層析法等。本實(shí)驗(yàn)采用凝膠層析法，其目的是利用蛋白質(zhì)與無機(jī)鹽類之間分子量的差異。當(dāng)溶液通過SephadexG-25凝膠柱時(shí)，溶液中分子直徑大的蛋白質(zhì)不能進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)孔，而分子直徑小的無機(jī)鹽能進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)孔之中．因此在洗脫過程中，小分子的鹽會(huì)被阻滯而后洗脫出來，從而可達(dá)到去鹽的目的。純化后的γ-球蛋白可利用醋酸纖維素薄膜電泳法鑒定其純度。 【實(shí)驗(yàn)試劑和器材】 1. 試劑 ⑴ 飽和硫酸銨溶液：稱取固體硫酸銨（ammonium sulfate)850g于1000 mL蒸餾水中，在70~80℃水浴中攪拌溶解，用濃氨水調(diào)pH為7.2，室溫放置過夜，瓶底析出白色結(jié)晶，上層液即為飽和硫酸銨溶液。 ⑵ 0.01 mol/L，pH 7.2磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS)：稱取NaH2PO4·2H2O 1.56 g，溶于1000 mL蒸餾水中，即為0.01 mol/L NaH2PO4液。稱取Na2HPO4·12H2O3.58 g，溶于1000 mL蒸餾水中，即為0.01 mol/L Na2HPO4液。 取0.01 mol/LNaH2PO4液280 mL，加0.01mol/L Na2HPO4液720 mL，混勻即為0.01 mol/L，pH 7.2磷酸鹽緩沖液。 ⑶ 葡聚糖凝膠G-25（Sephadex G-25)：按每100 mL凝膠床體積需要葡聚糖凝膠G-25干膠 25g。稱取所需量置于錐形瓶中。每克干膠加入蒸餾水約30 mL，用玻璃棒輕輕混勻，置于90~100℃水溫中時(shí)時(shí)攪動(dòng)，使氣泡逸出。1h后取出，稍靜置，傾去上清液細(xì)粒。也可于室溫中浸泡24h，攪拌后稍靜置，傾去上清液細(xì)粒，用蒸餾水洗滌2~3次，然后加0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0)平衡，備用。 ⑷ 10%三氯乙酸（acetocaustin)。 ⑸ 納氏試劑（Nessler"s reagent)：① 貯存液：稱取碘化鉀(KI)7.58于250mL三角燒瓶中，用蒸餾水5mL溶解，再加入碘（I2)5.5 g溶解，加7~7.5 g Hg，用力振搖10 min(此時(shí)產(chǎn)生高熱，須冷卻)，直至棕紅色的碘轉(zhuǎn)變成帶綠色的碘化汞鉀液為止，過濾上清液傾入100 mL容量瓶，洗滌沉淀，洗滌液一并倒入容量瓶內(nèi)，用蒸餾水稀釋至100 mL。② 應(yīng)用液：取貯存液75mL加10％NaOH 350 mL，加水至500mL，混勻，置棕色瓶內(nèi)，靜置數(shù)日后取其上清液使用。 溶解115g HgI2（mercuric iodide)和80g KI（potassium iodide)于蒸餾水中，稀釋至500 mL。加入500 mL6mol/L NaOH溶液，靜置后吸取上清液使用。試劑宜放置于陰涼處。 ⑹ pH8.6，離子強(qiáng)度0.06巴比妥電極緩沖液（barbital buffer)：稱取巴比妥鈉（barbital sodium)12.76g，巴比妥（barbital)1.66 g，蒸餾水加熱溶解后再加水至1000 mL。 ⑺ 氨基黑10B染色液：稱取氨基黑10B（amino black 10B)0.5 g，用甲醇50 mL，冰乙酸（glacial acetic acid)10 mL，蒸餾水40 mL溶解。 ⑻ 漂洗液：95%乙醇45 mL，加冰乙酸5 mL及蒸餾水50 mL。 2. 器材 ⑴ 電泳儀、電泳槽。 ⑵ 電動(dòng)離心機(jī)、層析柱。 ⑶ 鑷子、培養(yǎng)皿、X光軟片、濾紙。 ⑷ 離心管、燒杯、量筒、滴管、小試管、吸管。 ⑸ 瓷比色盤（黑色和白色各一個(gè))。 【實(shí)驗(yàn)步驟】 1. 分段鹽析 ⑴ 取血清1.0 mL加入離心管中，加磷酸鹽緩沖液（PBS)1.0 mL，混勻。再逐滴加入pH 7.2飽和硫酸銨液2.0 mL，邊加邊搖勻。靜置30分鐘后離心（3000 rpm×10分鐘)，傾去上清液（此液中主要含清蛋白)并盡量倒凈，沉淀為球蛋白。 ⑵ 將上述離心管中的沉淀用1.0 mL PBS攪拌溶解，再逐滴加入飽和硫酸銨液0.5 mL，混勻，靜置30分鐘后離心（3000 rpm×10分鐘)，傾去上清液（此液中主要含α、β-球蛋白)并盡量倒凈，其沉淀為初步純化的γ-球蛋白。如要獲得更純的γ-球蛋白，可重復(fù)此過程1~2次，最后用1.0 mLPBS將沉淀溶解。 2. 脫鹽 ⑴ 裝柱：取層析柱（Φ1×20cm)，關(guān)緊下端出口，加蒸餾水少許，緩慢加入葡聚糖凝膠G-25懸液，待底部沉積1~2 cm厚的凝膠后，打開下端出口，繼續(xù)加入凝膠至凝膠沉積10~15 cm高，注意凝膠床表面應(yīng)平整。凝膠柱經(jīng)PBS流洗平衡后即可使用。 ⑵ 上樣與洗脫：小心控制凝膠柱下端活塞，使柱上的緩沖液面剛好下降到凝膠床表面，關(guān)緊下端出口。用滴管吸取γ-球蛋白液，小心緩慢地沿層析柱內(nèi)壁加到凝膠床表面上，注意不要破壞凝膠床表面的平整。打開下端出口，使樣品進(jìn)入凝膠床，小心加入少許PBS于柱內(nèi)，待進(jìn)入凝膠床后再加入少許的PBS，如此重復(fù)三次，以洗凈柱內(nèi)壁上的樣品溶液，然后可加入多量的P衛(wèi)生資格考試網(wǎng)BS進(jìn)行洗脫，流速為4~5滴/分。 ⑶ 收集：事先應(yīng)準(zhǔn)備好10支試管，于加樣開始后立即收集洗脫液。每收集約1.0 mL換一管。 ⑷ 檢查：取瓷比色盤2個(gè)（一個(gè)為黑色背景，另一個(gè)為白色背景)，按洗脫液的管號(hào)順序分別取1滴滴于比色盤中，前者各加10%三氯乙酸5滴，出現(xiàn)白色混濁或沉淀者即有蛋白質(zhì)存在；后者各加納氏試劑1滴，出現(xiàn)顏色反應(yīng)者存在NH4+。將檢查結(jié)果用“-，+，++”等符號(hào)記錄于下表中。選取蛋白含量高且不含銨離子的樣品液進(jìn)行純度鑒定。
3. 純度鑒定 ⑴ 取2×8 cm大小的醋酸纖維素薄膜2張，于巴比妥緩沖液中充分浸濕。將浸透的膜條鑷出后用濾紙吸去多余的水分，于無光澤面點(diǎn)樣。 ⑵ 在距膜條一端約1.5 cm處，用X光軟片蘸取全血清和純化的γ-球蛋白樣品液分別點(diǎn)于兩張膜條上。如樣品液較稀，可多點(diǎn)幾次。 ⑶ 將巴比妥緩沖液加于電泳槽內(nèi)，再將點(diǎn)樣后的膜條放置于電泳槽槽架上，槽架上用四層濾紙作橋墊。放置時(shí)膜條的無光澤面應(yīng)向下，點(diǎn)樣端置于陰極，膜條與濾紙需貼緊。 ⑷ 接通電源，以150V恒壓電泳約45分鐘。 ⑸ 通電完畢后，用鑷子將膜條取出，浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染色1~2分鐘取出，立即浸入盛有漂洗液的培養(yǎng)皿中，反復(fù)漂洗數(shù)次，直到背景漂凈為止。用濾紙吸干膜條，比較純化前與純化后電泳圖譜的變化，以確定樣品的純度。 【實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)】 1. 裝柱是層析操作中最重要的一步。為使柱床裝得均勻，務(wù)必做到凝膠懸液不稀不厚，一般濃度為l:l，進(jìn)樣及洗脫時(shí)切勿使床面暴露在空氣中，不然柱床會(huì)出現(xiàn)氣泡或分層現(xiàn)象。加樣時(shí)必須均勻，切勿攪動(dòng)床面，否則均會(huì)影響分離效果。 2. 葡聚糖凝膠使用后如短期不再用，為防止凝膠發(fā)霉可加防腐劑如0.02％疊氮鈉，保存于4℃冰箱內(nèi)。若長期不用，應(yīng)脫水干燥保存，即將膨脹凝膠用水洗凈。用多孔漏斗抽干后，逐次更換由稀到濃的乙醇溶液浸泡若干時(shí)間，最后一次用95％乙醇溶液浸泡脫水，然后用多孔漏斗抽干后，于60~80℃烘干貯存。 實(shí)驗(yàn)方案二 【實(shí)驗(yàn)原理】 首先利用硫酸銨分段鹽析法將血清中的γ-球蛋白與清蛋白及α、β-球蛋白分離，再用葡聚糖凝膠過濾法除鹽。脫鹽后的蛋白質(zhì)溶液尚含有各種球蛋白，利用它們等電點(diǎn)的不同可進(jìn)行分離。 α-球蛋白、β-球蛋白的pI<6.0；γ-球蛋白的pI為7.2左右。因此在pH6.3的緩沖溶液中，各類球蛋白所帶電荷不同。經(jīng)DEAE(二乙基氨基乙基)纖維素陰離子交換層析柱進(jìn)行層析時(shí)，帶負(fù)電荷的α-球蛋白和β-球蛋白能與DEAE纖維素進(jìn)行陰離子交換而被結(jié)合；帶正電荷的γ-球蛋白則不能與DEAE纖維素進(jìn)行交換結(jié)合而直接從層析柱流出。因此隨洗脫液流出的只有γ-球蛋白，從而使γ-球蛋白粗制品被純化。其反應(yīng)式如下：
用上述方法分離得到γ-球蛋白是否純凈單一，可將純化前后的γ-球蛋白進(jìn)行電泳比較而鑒定之。 【實(shí)驗(yàn)試劑和器材】 1. 試劑 ⑴ 飽和硫酸銨溶液。 ⑵ 0.0175mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)：A液：稱取磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O) 2.730 g溶于蒸餾水中，加蒸餾水稀釋至1000 mL。B液：稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)6.269 g，溶于蒸餾水中，加蒸餾水稀釋至1000 mL。取A液77.5 mL，加于B液22.5 mL，混勻后即成。 ⑶ 葡聚糖凝膠（Sephadex G-25)： 按“實(shí)驗(yàn)方案一”溶脹后加0.0175 mol/L pH 6.3磷酸鹽緩沖液平衡。 ⑷ DEAE-32(二乙基氨基乙基-32)纖維素：按100 mL柱床體積需DEAE纖維素14 g稱取，每克加0.5mol/L鹽酸溶液15mL，攪拌。放置30min(鹽酸處理時(shí)間不可太長，否則DEAE纖維素變質(zhì))。加約l0倍量的蒸餾水?dāng)嚢�，放置片刻，待纖維素下沉后，傾棄含細(xì)微懸浮物的上層液。如此反復(fù)數(shù)次。靜置30min，虹吸去除上清液(也可用布氏漏斗抽干)，直至上清液pH>4為止。加等體積l mol/L氫氧化鈉溶液，使最終濃度約為0.5 mol/L氫氧化鈉，攪拌后放置30min，以虹吸除去上層液體。同上用蒸餾水反復(fù)洗至pH<quanxiangyun.cn/wszg/;7為止。虹吸去除上層液體，然后加入0.0175 mol/L pH 6.3磷酸鹽緩沖液平衡，備用。 ⑸ 20%磺基水楊酸溶液。 ⑹ 納氏試劑應(yīng)用液。 ⑺ 0.9％氯化鈉溶液。 ⑻ 醋酸纖維素薄膜電泳有關(guān)試劑。 2. 器材 ⑴ 電泳儀、電泳槽。 ⑵ 電動(dòng)離心機(jī)、層析柱2支。 ⑶ 自動(dòng)部份收集器 ⑷ 鑷子、培養(yǎng)皿、X光軟片、濾紙。 ⑸ 離心管、燒杯、量筒、滴管、小試管、吸管。 ⑹ 瓷比色盤（黑色和白色各一個(gè))。 【實(shí)驗(yàn)步驟】 1. 鹽析 ⑴ 取正常人血清2.0 mL于小試管中，加0.9％氯化鈉溶液2.0 mL，邊攪拌混勻邊緩慢滴加飽和硫酸銨溶液4.0 mL，混勻后于室溫中放置10min，3000 r/min離心10 min。 ⑵ 小心傾去含有清蛋白的上清液，重復(fù)洗滌一次，于沉淀中加入0.0175 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)0.5~1.0 mL使之溶解。此液即為粗提的γ-球蛋白溶液。 2. 脫鹽 ⑴ 裝柱：洗凈的層析柱保持垂直位置，關(guān)閉出口，柱內(nèi)留下約2.0 mL洗脫液。一次性將葡聚糖凝膠G-25從塑料接口加入層析柱內(nèi)，打開柱底部出口，調(diào)節(jié)流速0.3 mL/min。凝腔隨柱內(nèi)溶液慢慢流下而均勻沉降到層析柱底部，最后使凝膠床達(dá)20厘米高，床面上保持有洗脫液，操作過程中注意不能讓凝膠床表面露出液面并防止層析床內(nèi)出現(xiàn)“紋路”。在凝膠表面可蓋一園形濾紙，以免加入液體時(shí)沖起膠粒。 ⑵ 上樣與洗脫：可以在凝膠表面上加圓形尼龍濾布或?yàn)V紙使表面平整，小心控制凝膠柱下端活塞，使柱上的緩沖液面剛好下降至凝膠床表面，關(guān)緊下端出口，用長滴管吸取鹽析球蛋白溶液，小心緩慢加到凝膠床表面。打開下端出口，將流速控制在0.25 mL/min使樣品進(jìn)入凝膠床內(nèi)。關(guān)閉出口，小心加入少量0.0175 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)洗柱內(nèi)壁。打開下端出口，待緩沖液進(jìn)入凝膠床后再加少量緩沖液。如此重復(fù)三次，以洗凈內(nèi)壁上的樣品溶液。然后可加入適量緩沖液開始洗脫。 加樣開始應(yīng)立即收集洗脫液。洗脫時(shí)接通蠕動(dòng)泵，流速為0.5 mL/min，用自動(dòng)部份收集器收集，每管1mL。 ⑶ 洗脫液中NH4+與蛋白質(zhì)的檢查：取瓷比色盤2個(gè)（一個(gè)為黑色背景，另一個(gè)為白色背景)，按洗脫液的管號(hào)順序分別取1滴滴于比色盤中，前者各加20％磺基水楊酸溶液2滴，出現(xiàn)白色混濁或沉淀者即有蛋白質(zhì)存在；后者各加納氏試劑1滴，出現(xiàn)顏色反應(yīng)者存在NH4+。將檢查結(jié)果用“-，+，++”等符號(hào)記錄于下表中。選取蛋白含量高且不含銨離子的樣品液進(jìn)行純度鑒定。
合并球蛋白含量高的各管，混勻。除留少量作電泳鑒定外，其余用DEAE纖維素陰離子交換柱進(jìn)一步純化。 3. 純化 用DEAE纖維素裝柱約8~10 cm高度，并用0.0175 mol／L磷酸鹽緩沖液(pH6.3)平衡，然后將脫鹽后的球蛋白溶液緩慢加于DEAE纖維素陰離子交換柱上，用同一緩沖液洗脫、分管收集。用20%磺基水楊酸溶液檢查蛋白質(zhì)分布情況(裝柱、上樣、洗脫，收集及蛋白質(zhì)檢查等操作步驟同上)。 4. 濃縮 經(jīng)DEAE纖維素陰離于交換柱純化的γ-球蛋白液往往濃度較低。為便于鑒定，常需濃縮。收集較濃的純化的γ-球蛋白溶液2 m1，按每mL加0.2~ 0.25 g Sephadex G-25干膠，搖動(dòng)2~3min，3000 r/min離心5min。上清液即為濃縮的γ-球蛋白溶液。 5. 鑒定 取醋酸纖維素薄膜2條，分別將血清、脫鹽后的球蛋白、DEAE纖維素陰離子交換柱純化的γ-球蛋白液等樣品點(diǎn)上。然后參閱“實(shí)驗(yàn)方案一”進(jìn)行電泳分離、染色。比較電泳結(jié)果。 【實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)】 1. 凝膠及DEAE纖維處理期間，必須小心用傾瀉法除去細(xì)小顆粒。這樣可使凝膠及纖維素顆粒大小均勻，流速穩(wěn)定，分離效果好。 2. 層析柱柱床應(yīng)裝均勻，進(jìn)樣及洗脫時(shí)切勿使床面暴露在空氣中，加樣時(shí)必須均勻，切勿攪動(dòng)床面，否則均會(huì)影響分離效果。 3. 本法是利用γ-球蛋白的等電點(diǎn)與α-、β-球蛋白不同，用離子交換層析法進(jìn)行分離的。因此層析過程中用的緩沖液pH要求精確。 4. 離子交換劑的再生和保存：離子交換劑的價(jià)格較貴，每次用后只需再生處理便能反復(fù)使用多次。處理方法是：交替用酸、堿處理，最后用水洗至接近中性。陽離子交換劑最后為Na+型，陰離子以Cl－型是最穩(wěn)定型，故陰離子交換劑處理順序?yàn)閴A-水-酸-水。由于上述交換劑都是糖鏈結(jié)構(gòu)。容易水解破壞，因此須避免強(qiáng)酸、強(qiáng)堿長時(shí)間浸泡和高溫處理，一般纖維素浸泡時(shí)間為3~4h。 離子交換劑容易長霉引起變質(zhì)，不用時(shí)，需洗滌干凈，加防腐劑置冰箱內(nèi)保存。常用0.02％疊氮鈉防腐。疊氮鈉遇酸放出有毒氣體，也是劇毒與易爆的危險(xiǎn)品，使用時(shí)要加倍小心。 5. 除用凝膠層析法去除無機(jī)鹽類外，最常用的去鹽法就是透析。細(xì)的透析袋效率高，所需時(shí)間短。將透析袋一端折疊，用橡皮筋結(jié)扎，試驗(yàn)是否逸漏，然后倒入待透析的蛋白質(zhì)溶液。勿裝太滿，將袋的上端也結(jié)扎好，即可進(jìn)行透析。開始可用流動(dòng)的自來水，待大部分鹽被透析出后，再改為生理鹽水、緩沖液或蒸餾水。透析最好在較低的溫度下，并在磁力攪拌器上進(jìn)行。此法簡單，易操作，儀器及試劑要求不高，但不如凝膠層析法效率高。 6. 濃縮γ-球蛋白粗提液除上述方法外還可用透析袋濃縮。將待濃縮的蛋白質(zhì)溶液放入較細(xì)的透析袋中，置入搪瓷盤內(nèi)。透析袋周圍可撒上聚乙二醇6000(PEG6000)，或聚乙烯吡咯酮，或蔗糖。以上物質(zhì)在使用后(吸了大量水)都可以通過加溫及吹風(fēng)而回收；將裝有蛋白質(zhì)溶液的透析袋懸掛起來，用電風(fēng)扇高速吹風(fēng)(10℃以下)，也可達(dá)到濃縮目的，以上兩法雖不如 SephadexG-25干膠快，但價(jià)格較便宜，方法也不煩瑣。 【思考題】 1. 血清蛋白質(zhì)分為哪幾類？ 2. 如何計(jì)算血清白/球蛋白比率？其臨床意義有哪些？ 3. 怎樣去除樣品中的低分子鹽類？ 4. 蛋白質(zhì)分子為什么可以在溶液中穩(wěn)定存在？鹽析沉淀蛋白質(zhì)的原理是什么？ 5. 血清γ-球蛋白的分離純化采用了哪些分離純化方法？這些方法的原理分別是什么？ 6. 層析操作過程中有哪些注意事項(xiàng)？
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