病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)
張育華 王光西
第一篇 細(xì)菌學(xué)總論 細(xì)菌的形態(tài)學(xué)觀察 內(nèi)容： 一、顯微鏡油鏡的使用和保護(hù) 二、活菌運(yùn)動(dòng)的觀察 三、細(xì)菌的基本形態(tài)和特殊結(jié)構(gòu)觀察 四、細(xì)菌涂片標(biāo)本的制作和革蘭氏染色 實(shí)驗(yàn)一 顯微鏡油鏡的使用和保護(hù) (useandcareofoilmicroscope) 微生物體積微小，必須借助于顯微鏡將其放大數(shù)百倍至數(shù)萬(wàn)倍才能觀察到。因此，顯微鏡是認(rèn)識(shí)和研究微生物最重要和最基本的工具之一，掌握其使用方法是進(jìn)行微生物研究的基本技能。在細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查方面，以普通光學(xué)顯微鏡尤其是油鏡最常用。 【材料】 1、普通光學(xué)顯微鏡、香柏油、二甲苯、拭鏡紙。 2、細(xì)菌革蘭氏染色片。 【方法】 1、普通光學(xué)顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)(圖1) 2、油鏡的使用： (1)右手提住鏡臂，左手扶住鏡座，將顯微鏡平穩(wěn)地放于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。勿將鏡臂彎曲傾斜，以免香柏油流散。 (2)轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器，使低倍鏡對(duì)準(zhǔn)聚光器，將聚光器升到最高位置，用凹面鏡對(duì)光，完全打開光圈，使視野內(nèi)光線最強(qiáng)。 (3)將標(biāo)本固定在載物臺(tái)上，先在低倍鏡下找到標(biāo)本的適當(dāng)位置，再轉(zhuǎn)換為油鏡頭。油鏡頭上都有標(biāo)記，通常標(biāo)有90×或100×，刻有HI或oil等字樣，其前端有黑色、紅色或白色圓圈，透鏡孔徑較其它物鏡小。 (4)加一滴香柏油于標(biāo)本欲檢部位，用眼從油鏡頭側(cè)面觀察，同時(shí)調(diào)節(jié)粗調(diào)節(jié)器，使油鏡頭緩慢下降或載物臺(tái)緩緩上升，直至油鏡頭剛好浸于油內(nèi)。然后從目鏡觀察，緩慢調(diào)節(jié)粗調(diào)節(jié)器，直到出現(xiàn)模糊物象，再用細(xì)調(diào)節(jié)器將物象調(diào)至清晰。 3、顯微鏡的保護(hù) (1)使用時(shí)應(yīng)小心和愛惜，勿隨意拆卸。 (2)保持物鏡和目鏡的清潔。每次使用完油鏡后，應(yīng)立即用滴有少許二甲苯的拭鏡紙擦凈鏡頭，再用干凈的拭鏡紙擦去鏡頭上的二甲苯，以防鏡片脫落。 (3)顯微鏡用畢，應(yīng)降下聚光器，并將物鏡轉(zhuǎn)開，使之呈八字形，蓋上鏡罩，放入鏡箱。 (4)宜將顯微鏡放置于干燥處，但又要防止陽(yáng)光曝曬。 (5)勿用強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、酒精、乙醚等擦拭顯微鏡。 【注意事項(xiàng)】 1、用油鏡觀察時(shí)，一定要注意標(biāo)本的正反面，標(biāo)本面應(yīng)向上。 2、載玻片的厚度應(yīng)適當(dāng)，不宜太厚。 3、一定要等標(biāo)本完全干燥后，才滴加香柏油。 4、滴加香柏油的量以1滴為宜。 5、鏡頭上陳舊的香柏油也可用二甲苯軟化。 附：香柏油的作用原理(圖2) 圖1 普通光學(xué)顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)1、目鏡 2、鏡筒 3、物鏡轉(zhuǎn)換器 4、物鏡 5、載物臺(tái)6、光圈 7、聚光器 8、反光鏡 9、鏡座 10、粗調(diào)節(jié)器11、細(xì)調(diào)節(jié)器 12、鏡臂 13、聚光器調(diào)節(jié)器
實(shí)驗(yàn)二 活菌運(yùn)動(dòng)的觀察 （observationofmotilityoflivingbacteria) 鞭毛是細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)器官，有鞭毛的細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中作定向運(yùn)動(dòng)，因而有位置的移動(dòng)；無鞭毛的細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中，由于受到液體中其它分子不規(guī)則布朗運(yùn)動(dòng)的沖擊，只能在原處作不規(guī)則的分子顫動(dòng)，而不發(fā)生位置的移動(dòng)。 【材料】 1、普通變形桿菌、葡萄球菌8~12h的肉湯培養(yǎng)物。 2、載玻片、蓋玻片、凹玻片、凡士林、接種環(huán)、鑷子、普通光學(xué)顯微鏡。 【方法】 一、壓滴法 1、用接種環(huán)各取2～3環(huán)普通變形桿菌、葡萄球菌肉湯培養(yǎng)物，分別置于兩張載玻片的中央。 2、用鑷子挾住蓋玻片，使其一邊接觸菌液，然后緩緩放下，勿使菌液外溢，以不產(chǎn)生氣泡為宜。 3、將標(biāo)本置于高倍鏡下，觀察細(xì)菌運(yùn)動(dòng)情況。 1、取兩張凹玻片，凹窩四周涂少許凡士林。 2、各取一環(huán)普通變形桿菌、葡萄球菌肉湯培養(yǎng)物，分別置于兩張蓋玻片的中央。 3、反轉(zhuǎn)凹玻片，扣于蓋玻片上，使凹窩正對(duì)蓋玻片中央。輕壓之，使凡士林粘住蓋玻片后，再反轉(zhuǎn)，菌液則懸垂在凹窩中央。 4、置低倍鏡下找到懸滴的邊緣后，再用高倍鏡觀察。 【結(jié)果】 普通變形桿菌作定向運(yùn)動(dòng)，提示其有鞭毛；葡萄球菌作布朗運(yùn)動(dòng)，提示其無鞭毛。 【注意事項(xiàng)】 用上述兩種方法觀察時(shí)，均需適當(dāng)降低聚光器及縮小光圈，使視野光線較暗。 實(shí)驗(yàn)三 細(xì)菌的基本形態(tài)和特殊結(jié)構(gòu)觀察 （observationofbacterialbasicshapeandspecialstructure) 各種細(xì)菌細(xì)胞在一定的環(huán)境條件下，都有其相對(duì)恒定的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。觀察細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)，有助于細(xì)菌的鑒定、感染性疾病的診斷和治療。 細(xì)菌的基本形態(tài)有球形、桿狀和螺形三種。經(jīng)革蘭氏染色法染色后，可在顯微鏡下鑒別細(xì)菌的形態(tài)、大小、排列方式和染色性。細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)包括莢膜、芽胞、鞭毛和菌毛，其中菌毛必須在電子顯微鏡下才能觀察到，其余三種也需要通過各自特殊的染色，才能在油鏡下查見。 【材料】 1、球菌示教片：葡萄球菌、鏈球菌、肺炎雙球菌、腦膜炎雙球菌、淋球菌革蘭氏染色片。 2、桿菌示教片：大腸桿菌革蘭氏染色片。 3、螺形菌示教片：水弧菌革蘭氏染色片。 4、鞭毛示教片：普通變形桿菌鞭毛染色片。 6、莢膜示教片：肺炎雙球菌莢膜染色片。 【方法】 l、在油鏡下觀察各種形態(tài)的細(xì)菌，比較它們?cè)陬伾⒋笮�、形態(tài)和排列方式上的差別。 2、用油鏡觀察細(xì)菌的各種特殊結(jié)構(gòu)，注意鞭毛的數(shù)量和位置；芽胞的大小、形態(tài)和位置；莢膜的厚度、顏色。 【結(jié)果】 請(qǐng)將觀察結(jié)果以繪圖方式記錄如下： 實(shí)驗(yàn)四 細(xì)菌涂片標(biāo)本的制作和革蘭氏染色 （preparationofbacterialsampleandgramstain) 細(xì)菌體積微小，為五色半透明體，若不經(jīng)染色直接在顯微鏡下觀察，僅能初略觀察其大小和形態(tài)。若要識(shí)別細(xì)菌的各種結(jié)構(gòu)，則必須進(jìn)行染色。細(xì)菌的染色方法有多種，其中革蘭氏染色是應(yīng)用最廣泛的細(xì)菌染色法。用這種方法可以將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽(yáng)性。 菌和革蘭氏陰性菌兩類，對(duì)于鑒別細(xì)菌、研究細(xì)菌的致病性和選用抗菌藥物均有重要價(jià)值。 革蘭氏染色法的原理目前仍未完全闡明，大多數(shù)學(xué)者傾向于細(xì)胞壁學(xué)說。該學(xué)說認(rèn)為：革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)比較致密，肽聚糖層厚，脂質(zhì)含量少，乙醇不易透入，反而可使細(xì)胞壁脫水而形成一道屏障，阻止染料向細(xì)胞外滲出，細(xì)菌仍保留結(jié)晶紫初染的紫色；革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁疏松，肽聚糖層很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂質(zhì)，易被乙醇溶解，增加了細(xì)胞的通透性，使結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，細(xì)胞脫色后經(jīng)復(fù)紅復(fù)染，著上紅色。 【材料】 1、大腸桿菌、葡萄球菌18～24h培養(yǎng)物。 2、結(jié)晶紫染液、盧戈氏碘液、石炭酸復(fù)紅稀釋液、95％乙醇。 3、載玻片、接種環(huán)、生理鹽水、酒精燈等。 【方法】 1、細(xì)菌涂片標(biāo)本的制備：涂片干燥固定。 (1)涂片：用接種環(huán)取l～2環(huán)生理鹽水置于一張潔凈載玻片中央。將接種環(huán)滅菌后，刮取少許菌苔于生理鹽水中碾磨成乳濁狀，并涂成直徑約1cm2的菌膜(若用細(xì)菌的液體培養(yǎng)物制片，可直接取材涂片，不用加生理鹽水)。 (2)干燥：最好自然干燥。必要時(shí)也可將涂片的標(biāo)本面向上，在離酒精燈火焰較遠(yuǎn)的高空處小心烘干。切勿靠火焰太近，以免將標(biāo)本烤枯，細(xì)菌變形，影響結(jié)果觀察。 (3)固定：手執(zhí)載玻片一端，標(biāo)本面向上，在酒精燈火焰外層上以鐘擺速度來回通過三次，目的是殺死細(xì)菌，匣菌體與玻片粘附更牢固，染料更容易進(jìn)入菌體(圖4)。 2、革蘭氏染色： (1)初染：滴加1～2滴結(jié)晶紫染液于標(biāo)本菌膜上，1min后，用水沖洗，并傾去玻片上的余水。 (2)媒染：加盧戈氏碘液l～2滴于菌膜上，1min后，用水沖洗，并傾去玻片上的余水。 (3)脫色：加95％乙醇1～2滴于菌膜上，輕輕晃動(dòng)玻片約30秒鐘，然后用水沖洗，并傾去玻片上的余水。 (4)復(fù)染：加石炭酸復(fù)紅稀釋液1～2滴于菌膜上，用水沖洗，并傾去玻片上的余水。待標(biāo)本干燥后，用油鏡觀察。 【結(jié)果】 葡萄球菌是革蘭氏陽(yáng)性菌，被染成紫色；大腸桿菌是革蘭氏陰性菌，被染為紅色。 【注意事項(xiàng)】 1、細(xì)菌涂片時(shí)，菌膜應(yīng)薄而均勻。 2、在染色過程中，應(yīng)該用細(xì)小水流沖洗，且水流不宜直接沖在菌膜上。 3、革蘭氏染色的結(jié)果受多種因素影響，如細(xì)菌的培養(yǎng)時(shí)間、染色技術(shù)等。染色中應(yīng)特別注意掌握好脫色的時(shí)間過長(zhǎng)或過短均會(huì)影響染色結(jié)果。氣溫較高時(shí)，脫色時(shí)間可稍短；氣溫較低時(shí)，脫色時(shí)間可稍長(zhǎng)。 【思考題】 1、掌握細(xì)菌各種特殊結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)有何意義? 2、細(xì)菌涂片標(biāo)本的菌膜過厚，對(duì)革蘭氏染色的結(jié)果有什么影響? 3、經(jīng)革蘭氏染色后，葡萄球菌若被染為紅色，試分析其原因。 細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖和代謝 內(nèi)容： 一、基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備 二、細(xì)菌的接種法和生長(zhǎng)現(xiàn)象觀察 三、細(xì)菌代謝產(chǎn)物的檢查 第二篇 細(xì)菌各論實(shí)驗(yàn) 球菌是細(xì)菌中的一個(gè)大類，根據(jù)染色性不同分為革蘭氏陽(yáng)性球菌與革蘭氏陰性球菌。革蘭氏陽(yáng)性病原性球菌主要有葡萄球菌、鏈球菌、肺炎鏈球菌。革蘭氏陰性病原性球菌主要有腦膜炎球菌和淋球菌。 內(nèi)容： 一、病原性球菌的形態(tài)特征及培養(yǎng)特性 二、膿汁標(biāo)本病原菌的分離鑒定 三、病原性球菌幾種常用的生化檢查方法及致病性測(cè)定 病原性球菌 實(shí)驗(yàn)十六 病原性球菌的形態(tài)特征及培養(yǎng)特性 目的要求： 掌握病原性葡萄球菌、鏈球菌、肺炎鏈球菌、腦住院醫(yī)師膜炎球菌的形態(tài)特征、染色性及菌落特征。 【材料】 1、葡萄球菌、鏈球菌、腦膜炎球菌和淋球菌革蘭氏染色示教片，肺炎鏈球菌莢膜染色示教片。 2、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌在普通平板上18-24h培養(yǎng)物，金黃色葡萄球菌、甲型、乙型溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌在血平板上18～24h培養(yǎng)物。 【方法】 1、鏡下觀察葡萄球菌、鏈球菌、肺炎鏈球菌、腦膜炎球菌和淋球菌，注意他們的形態(tài)、大小、染色性和排列方式，仔細(xì)觀察肺炎鏈球菌的特殊結(jié)構(gòu)(莢膜)。 2、觀察幾種葡萄球菌在普通平板上形成的色素顏色，觀察金黃色葡萄球菌，甲型、乙型溶血性鏈球菌，肺炎鏈球菌在血平板上的生長(zhǎng)現(xiàn)象，主要從菌落大小、顏色、有無溶血現(xiàn)象三個(gè)方面觀察。 【結(jié)果】 l、形態(tài)及染色觀察：見表 2、菌落觀察： (1)金黃色、表皮、腐生葡萄球菌菌落均為圓形、隆起、濕潤(rùn)、光滑、邊緣整齊、不透明的中等大小菌落，各自形成金黃色、白色、檸檬色脂溶性色素，培養(yǎng)基不著色，金黃色葡萄球菌菌落周圍有五色透明較寬的完全溶血環(huán)。 (2)鏈球菌為灰白色、表面光滑、邊緣整齊的細(xì)小菌落，甲型溶血性鏈球菌菌落周圍形成草綠色半透明狹窄的溶血環(huán)，乙型溶血性鏈球菌菌落周圍形成五色透明較寬的溶血環(huán)，丙型鏈球菌無溶血環(huán)。 (3)肺炎鏈球菌菌落圓形，光滑，中心凹陷，邊緣隆起，半透明，針尖大小，菌落周圍有草綠色半透明狹窄的溶血環(huán)。 表6 幾種病原性球菌的菌體形態(tài)及染色性
實(shí)驗(yàn)十七 膿汁標(biāo)本病原菌的分離鑒定 從臨床標(biāo)本中，根據(jù)各種化膿性球菌不同的生物學(xué)特性，通過直接涂片鏡檢、分離培養(yǎng)、觀察生化反應(yīng)等方法，可鑒定出未知的化膿性球菌，不僅可提供化膿性感染疾病臨床診斷的依據(jù)，而且可進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，為臨床選用有效的抗菌藥物提供參考。本實(shí)驗(yàn)主要以葡萄球菌、鏈球菌、肺炎鏈球菌、腦膜炎球菌和淋球菌為檢查對(duì)象。 目的與要求 熟悉病原性球菌的分離、鑒定方法。 【材料與方法】 l、標(biāo)本采集和處理 (1)膿標(biāo)本：用無菌棉簽，蘸取患處深部膿液少許，置入無菌空試管內(nèi)，送檢。 (2)痰標(biāo)本：用消毒過的容器收集病人痰液，以無菌棉簽挑取病人膿稠痰塊，置入無菌空試管內(nèi)，送檢。 (3)咽喉部標(biāo)本：令病人把口張大，用壓舌板壓住舌根部，用無菌棉簽，迅速蘸取咽喉部分泌物，置入無菌空試管內(nèi)，送檢。 (4)血標(biāo)本：疑為化膿性球菌敗血癥患者，在嚴(yán)格無菌操作下，靜脈釆血5-6ml，床旁直接加入50m1的肉湯瓶?jī)?nèi)，立即搖勻，送檢。 (5)腦脊液標(biāo)本：需做腦脊液細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)的病人，在嚴(yán)格無菌操作下，做腰椎穿刺，取腦脊液置入無菌容器內(nèi)，立即送檢。 (6)尿道、陰道分泌物標(biāo)本：對(duì)淋病可疑患者，男性可從尿道取材，取材時(shí)無菌棉簽應(yīng)進(jìn)入尿道1-2cm，如剛排尿，應(yīng)等待1小時(shí)左右。女性則可從宮頸口取分泌物，當(dāng)無菌棉簽插入宮頸口后應(yīng)稍等片刻，再旋轉(zhuǎn)1～2分鐘拿出。取材后應(yīng)立即送檢，不可放置冰箱。 2、分離與鑒定 根據(jù)檢查的要求和目的，按下圖所示進(jìn)行分離鑒定。
【結(jié)果】 通過上述檢查，得出標(biāo)本中化膿性球菌的種類和細(xì)菌藥物敏感試驗(yàn)的結(jié)果。 【注意事項(xiàng)】 1、上面只表明一般的檢查原則，在實(shí)際檢查中，還須根據(jù)臨床提供的可能診斷，做定向的檢查。 2、若疑為流腦或淋病患者，其標(biāo)本送檢時(shí)，要注意保溫，所用的培養(yǎng)基要提前放人孵箱內(nèi)預(yù)溫。 3、在檢查腦膜炎球菌或淋球菌時(shí)，如需做細(xì)菌培養(yǎng)，應(yīng)選用巧克力血瓊脂平板。 實(shí)驗(yàn)十八 病原性球菌的幾種常用生化檢查方法及致病性的測(cè)定 目的與要求 掌握血漿凝固酶試驗(yàn)(玻片法)，熟悉膽汁溶菌試驗(yàn)，了解抗鏈球菌“O”溶血素試驗(yàn)。 (一)血漿凝固酶試驗(yàn) 大多數(shù)致病性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，使人或動(dòng)物血漿發(fā)生凝固。因此，測(cè)定血漿凝固酶的有無是鑒定葡萄球菌致病性的重要依據(jù)。血漿凝固酶分為結(jié)合于菌體的結(jié)合凝固酶和分泌至菌體外的游離凝固酶，可分別由玻片法和試管法測(cè)定。 [玻片法] 【材料】 1、金黃色、表皮葡萄球菌瓊脂斜面培養(yǎng)物。 2、兔血漿、生理鹽水。 3、玻片、接種環(huán)等。 【方法】 1、將玻片分為3格，用接種環(huán)分別取2～3環(huán)生理鹽水。 2、從瓊脂斜面挑取金黃色葡萄球菌，分別混懸于第1格和第3格內(nèi)，挑取表皮葡萄球菌，混懸于第2格。 3、在第1、2格分別加入兔血漿各一環(huán)并混勻，第3格不加兔血漿。靜止片刻，觀察結(jié)果。 【結(jié)果】 第3格和第2格不凝聚；第1格中金黃色葡萄球菌凝集成塊，即判定為血漿凝固酶陽(yáng)性。 表7 血漿凝固酶試驗(yàn)
【試管法】 【材料】 1、金黃色、表皮葡萄球菌瓊脂斜面培養(yǎng)物。 2、兔血漿、生理鹽水。 3、1ml刻度吸管、小試管。 【方法】 l、稀釋血漿：將生理鹽水與兔血漿作l:4稀釋，然后分別吸取0.5ml置于2只小試管內(nèi)。 2、從斜面上分別挑取金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌各數(shù)環(huán)于血漿管中，制成濃厚的懸液。置37℃水浴30分鐘，觀察結(jié)果。 【結(jié)果】 接種金黃色葡萄球菌的管中血漿凝固，接種表皮葡萄球菌的管中血漿不凝固，前者為凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性，后者為凝固酶試驗(yàn)陰性。 (二)膽汁溶菌試驗(yàn) 由于肺炎鏈球菌能產(chǎn)生自溶酶，可使細(xì)菌本身發(fā)生溶解。而自溶酶可被膽汁、膽鹽或其他表面活性物質(zhì)激活而進(jìn)一步增加其活性，加速菌體的溶解。憑借此試驗(yàn)可鑒別肺炎鏈球菌與甲型溶血性鏈球菌。 l、肺炎鏈球菌菌液，甲型溶血性鏈球菌菌液。 2、10％去氧膽酸鈉溶液，生理鹽水。 3、水浴箱、吸管、試管等。 【方法】 1、按表排列試管，并加入各成分。 表8 膽汁溶菌試驗(yàn) 單位:ml
【結(jié)果】 1號(hào)管由混濁變清亮，表明細(xì)菌被溶解，即為膽汁溶菌試驗(yàn)陽(yáng)性。其余各管無變化，為陰性。 【注意事項(xiàng)】 1、去氧膽酸鈉在酸性環(huán)境下易沉淀，故菌液應(yīng)是弱堿性。 2、粗糙型或死的肺炎鏈球菌，可以不表現(xiàn)出膽溶現(xiàn)象。 3、膽鹽溶菌過程，是加速自然溶菌的過程，膽鹽本身沒有直接的溶菌作用。 4、此試驗(yàn)為定性試驗(yàn)，故所用菌液以肉眼可見混濁即可。 (三)抗鏈球菌溶血素“O”試驗(yàn) 乙型溶血性鏈球菌產(chǎn)生的溶血素“O”(strepto1ysino,SLO)，為含有～SH基的蛋白質(zhì)，在還原狀態(tài)其溶血性活躍，遇氧時(shí)，～SH基被氧化為～S～S～基，失去溶血活性。由于SLO有很強(qiáng)的免疫原性，多數(shù)人感染該菌后，血清中出現(xiàn)較高水平的抗O抗體，并可至病愈后數(shù)月至數(shù)年才消失。因此，測(cè)定患者血清中抗O抗體的效價(jià)，常作為風(fēng)濕熱及其活動(dòng)性的輔助診斷。 在體外，以還原溶血素為抗原與待檢血清混合后觀察結(jié)果，如血清中有相應(yīng)抗體，則可中和溶血素使其失去溶血活性，再加紅細(xì)胞時(shí)不溶血，呈現(xiàn)抗“O”陽(yáng)性反應(yīng)，反之，則為陰性。 【材料】 1、被檢血清(加熱56℃30分鐘滅活，用生理鹽水稀釋為1:200)、鏈球菌溶血素、還原劑、生理鹽水、2％兔紅細(xì)胞。 2、小試管、吸管、水浴箱等。 【方法】 1、配制還原溶血素：取鏈球菌溶血素片劑及還原劑各一片，置小試管中，加生理鹽水1ml，用玻璃棒攪碎，放室溫15分鐘使溶血素還原，最后補(bǔ)充生理鹽水7ml，制成還原溶血素“O”。 2、取5支小試管，分別編號(hào)，按表進(jìn)行操作。 表9 抗“O”實(shí)驗(yàn)操作表 單位：ml
【結(jié)果】 觀察結(jié)果時(shí)，應(yīng)輕輕取出試管(勿搖動(dòng))，對(duì)光檢查有無溶血現(xiàn)象(溶血者上清液呈透明紅色，不溶血者混濁)。完全不溶血的血清最高稀釋度即為抗鏈球菌溶血素“O”的效價(jià)。一般正常人血清效價(jià)在I：250以內(nèi)，大于l：400有診斷意義，表明機(jī)體近期感染過溶血性鏈球菌。風(fēng)濕熱、腎小球腎炎等鏈球菌感染性疾病，效價(jià)逐步增高提示為活動(dòng)期，反之則為緩解期。 【思考題】 1、說明幾種病原性球菌的菌體形態(tài)及特征。 2、為什么對(duì)葡萄球菌的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)要做致病性鑒定?有哪些方法?最常用的是哪種方法?
第三篇 其它微生物及病毒實(shí)驗(yàn) 螺旋體的檢查 內(nèi)容： 一、鉤端螺旋體暗視野顯微鏡觀察 二、鉤端螺旋體凝集溶解試驗(yàn) 三、梅毒螺旋體鍍銀染色片觀察 四、梅毒血清學(xué)～～RPR試驗(yàn) 五、口腔標(biāo)本涂片剛果紅染色檢查奮森氏螺旋體 目的要求 熟悉幾種主要原性螺旋體的形態(tài)特征及染色性。 螺旋體是一類細(xì)長(zhǎng)、柔軟、彎曲呈螺旋狀、運(yùn)動(dòng)活潑、革蘭氏陰性的原核細(xì)胞型微生物。螺旋體種類很多，對(duì)人致病的主要有鉤端螺旋體、梅毒螺旋體和回歸熱螺旋體。 實(shí)驗(yàn)三十三 鉤端螺旋體形態(tài)觀察 (一)鉤端螺旋體活標(biāo)本暗視野觀察 【材料】鉤端螺旋體培養(yǎng)物、載玻片、蓋玻片、暗視野顯微鏡、暗視野顯微鏡燈源、酒精燈、接種環(huán)。 【方法】取鉤體培養(yǎng)液滴于載玻片上，覆以蓋玻片。在暗視野顯微鏡聚光器上加l滴香柏油，使載玻片背面與香柏油接觸，低倍鏡下調(diào)節(jié)反光鏡，使光集中在聚光器上。調(diào)清楚視野后，再換高倍鏡觀察。可在黑色背景中清楚地看到閃爍光亮的螺旋體，運(yùn)動(dòng)活潑，同時(shí)具有特殊運(yùn)動(dòng)方式，如同原蟲一樣的蠕動(dòng)、彎曲成角、旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)、一端或兩端彎曲呈鉤狀。 附：暗視野顯微鏡原理 暗視野顯微鏡是將普通顯微鏡的聚光器換成一個(gè)暗視野聚光器，該聚光器中央有一個(gè)黑色擋光板，光線不能直接進(jìn)入物鏡頭，而只能從擋光板周邊縫隙折射到載玻片上。當(dāng)光線通過載玻片上的標(biāo)本時(shí)，由于標(biāo)本與周圍物體折光率不同而引起光的折射，使一部分光線進(jìn)入物鏡頭，從而可在黑色的背 (二)固定標(biāo)本片（宜薄)，F(xiàn)ontana氏鍍銀染色法觀察： (1)鉤體標(biāo)本涂片(宜薄)，自然干燥(不用火焰固定)。 (2)滴加固定液(冰醋酸1ml，甲醛2ml，蒸餾水10m1，作用1～2min)。 (3)用無水乙醇洗滌。 (4)滴加媒染液(鞣酸5g，石炭酸1g，蒸餾水100m1)2～3滴，加溫至發(fā)生蒸汽，染30sec，水洗： (5)滴加氨銀溶液(5％硝酸銀液，逐滴加入10％氨液，至所產(chǎn)生的棕色沉淀物經(jīng)輕輕搖動(dòng)溶解為止)，并加熱使產(chǎn)生蒸汽，染30sec，水洗。干后用加拿大樹校膠片，鏡檢。 【結(jié)果】 背景為淡棕色，鉤體染成棕褐色，一端或兩端有鉤，但螺旋不清楚。 實(shí)驗(yàn)三十四 凝集溶解試驗(yàn) 凝集溶解試驗(yàn)是一種血清學(xué)反應(yīng)，用來測(cè)定病人血清的抗體或用已知血清鑒定所分離到的鉤端螺旋體型別。但不同于細(xì)菌凝集反應(yīng)，鉤端螺旋體遇到相應(yīng)抗體可發(fā)生產(chǎn)凝集，但抗體濃度大時(shí)則可溶菌，故稱為凝集溶解反應(yīng)。 1、在有機(jī)玻璃凹孔板上，按表順序加入各成分量后搖勻，置37℃2h。 表12 凝集溶解試驗(yàn)
2、2h后，從各孔中分別吸取1滴于載玻片上，覆以蓋玻片，在商視野顯微鏡下觀察。 3、結(jié)果判定 “++++”：幾乎全部鉤體發(fā)生凝集，偶見極少數(shù)正常鉤體存在。 “+++”：75％以上鉤體凝集，凝集者呈蜘蛛狀，見少數(shù)游離。 “++”：50％以上鉤體凝集呈現(xiàn)蜘蛛狀，約有半數(shù)不凝集。 “+”：25％以上鉤體凝集呈現(xiàn)小蜘蛛狀，大多數(shù)游離運(yùn)動(dòng)活潑。 “～”：鉤體正常分散存在。 無凝集現(xiàn)象生理鹽水對(duì)照：全部鉤體正常，運(yùn)動(dòng)活動(dòng)，分散存在。 凝溶試驗(yàn)通常以出現(xiàn)“++”的最高稀釋度為該血清最終效價(jià)，效價(jià)1：400以上才有診斷意義。 實(shí)驗(yàn)三十五 梅毒螺旋體形態(tài)觀察 （一)梅毒螺旋鍍銀染色片示教，油鏡下的背景為淡黃褐色，螺旋體呈棕褐色至棕黑色。 (二)梅毒血清試驗(yàn)～～RPR試驗(yàn) RPR試驗(yàn)，即快速血漿反應(yīng)素卡片實(shí)驗(yàn)(rapidplasmareagincardtest)，是一種正相間接凝集反應(yīng)。將患者廁清與吸附于活性炭的心磷脂～膽固醇的類脂質(zhì)抗原混合，出現(xiàn)不同程度的黑色素凝集顆�；蛐跗瑸殛�(yáng)性。 【方法】 定性試驗(yàn)：取待檢血清50pL，加至卡片上，并擴(kuò)大到整個(gè)圓圈。每份血清上滴加RPR抗原]滴(約50цL)，旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)8min，立即用肉眼觀察結(jié)果。 定量試驗(yàn)：定性試驗(yàn)陽(yáng)性者，可在RPR卡片上將血清作1:2-1:64稀釋后，按定性方法操作進(jìn)行定量試驗(yàn)。 結(jié)果判定： 定性：陰性標(biāo)本反應(yīng)液中不出現(xiàn)黑色素凝集顆粒。陽(yáng)性標(biāo)本反應(yīng)液中可見明顯黑色素效集顆粒或絮片。 定量：以肉眼為觀察標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)顆�；蛐跗拇笮�，記錄“+”～”++++”或“～”： “++++”：明顯塊狀沉淀，溶液明亮。 “+++”：呈現(xiàn)大顆粒，溶液明亮。 “++”：呈現(xiàn)小顆粒，溶液明亮。 “+”：僅顯細(xì)小顆粒，溶液混濁。 “±”：僅呈輕微絮狀，液體混濁，為可疑反應(yīng)。 “～”：清晰無顆粒。 抗原對(duì)照應(yīng)呈現(xiàn)乳光，完全液化。
第四篇 寄生蟲學(xué)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)四十六 溶組織內(nèi)阿米巴(Entamoeba histolytica) 目的要求： 1、掌握溶組織內(nèi)阿米巴的各期形態(tài)特點(diǎn)。 2、掌握碘液染色法檢查溶組織內(nèi)阿米巴包囊的方法。 3、認(rèn)識(shí)非致病阿米巴與溶組織內(nèi)阿米巴的區(qū)別特點(diǎn)。 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容： 一、自學(xué)標(biāo)本： 1、活的阿米巴滋養(yǎng)體：用生理鹽水直接涂片法作涂片，立即用低倍鏡尋找。查見不規(guī)則能運(yùn)動(dòng)的滋養(yǎng)體，然后換高倍鏡，仔細(xì)觀察其阿米巴運(yùn)動(dòng)，偽足的特點(diǎn)。 2、溶組織內(nèi)阿米巴包囊：以碘染色后，低倍鏡尋找，高倍鏡觀察構(gòu)造，包囊為黃綠色的圓形小體，囊壁，核膜與核仁均著色，糖原塊呈棕黃色，因折光的原因可發(fā)亮或暗色，包囊的擬染色體不著色。注意觀察溶組織內(nèi)阿米巴包囊的大小、形狀、顏色、核和糖原塊等構(gòu)造。 二、示教標(biāo)本：鐵蘇木素染色標(biāo)本，以油鏡觀察阿米巴的形態(tài)構(gòu)造，要觀察到 所有的構(gòu)造，可一邊仔細(xì)調(diào)節(jié)細(xì)螺旋，一邊觀察。 1、溶組織內(nèi)阿米巴大滋養(yǎng)體：注意大小，內(nèi)、外質(zhì)區(qū)別明顯，內(nèi)質(zhì)中可見被吞噬的紅細(xì)胞，體積較小，被染成黑色。滋養(yǎng)體有核一個(gè)，圓形、呈車輪狀，核膜內(nèi)緣有一層細(xì)而排列整齊的染色質(zhì)粒。核仁一個(gè)，小點(diǎn)狀，居中。 2、溶組織內(nèi)阿米巴包囊：注意大小、形狀，核的數(shù)目和構(gòu)造，擬染色醫(yī)學(xué)全.在線quanxiangyun.cn體形狀，有無糖原塊。 3、與其它非致病阿米巴的形態(tài)鑒別，如結(jié)腸內(nèi)阿米巴包囊。 三、技術(shù)操作 碘液染色法 (1)滴一滴碘液于載玻片上，以竹簽蘸取糞便少許，混合涂布于碘液中(或在碘液附近滴一滴糞便沉淀液)然后以蓋玻片的棱角調(diào)勻，以此蓋玻片蓋于液體上。 (2)作好的片子放于低倍鏡下仔細(xì)尋找包囊，找到后，再換高倍鏡觀察結(jié)構(gòu)。 注意事項(xiàng)： 1、請(qǐng)勿用油鏡觀察碘液染色的片子。 2、在觀察碘液染色標(biāo)本時(shí)，載物臺(tái)要放平，光線稍強(qiáng)，并須耐心尋找，尤其較小的包囊更須細(xì)心。 3、將涂用的竹簽和用后的玻片，放在指定的地方。 作業(yè)： 繪圖：碘染色的溶組織內(nèi)阿米巴包囊，注明結(jié)構(gòu)。 思考題： 1、對(duì)溶組織內(nèi)阿米巴急性患者和帶蟲者的糞便各采取何方法檢查病原體? 2、檢查阿米巴滋養(yǎng)體時(shí)應(yīng)注意什么問題? 實(shí)驗(yàn)四十七 杜氏利什曼原蟲(Leishmania donovani) 目的要求： 1、掌握杜氏利什曼原蟲無鞭毛體的形態(tài)特征。 3、觀察本蟲前鞭毛體的形態(tài)及傳播利什曼病的中華白蛉。 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容： 一、自學(xué)標(biāo)本：無鞭毛體(利杜體)：患者骨髓穿刺液染色涂片或人工感染的田鼠肝、脾印片，經(jīng)吉氏或瑞氏染液染色制片。因?yàn)樵x甚小，故直接在油鏡下尋找，并觀察其結(jié)構(gòu)。注意大小(和紅細(xì)胞比較)，細(xì)胞顏色，核和動(dòng)基體的位置變化很大，有時(shí)只能看到核，而看不到動(dòng)基體，有時(shí)核偏于一側(cè)或一端，而動(dòng)基體居于中央。 注意事項(xiàng)：被侵襲的網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞由于膨脹過大，在涂片時(shí)往往破裂，而利杜體散于血漿中。要與血小板相區(qū)別，利杜體較大，細(xì)胞質(zhì)包有較規(guī)則的膜，而血小板較小一般不超過2微米，常呈星形或多角形，成群分布。 二、示教標(biāo)本 1、前鞭毛體：顯微鏡下觀察，注意大小，形狀，鞭毛，動(dòng)基體的位置以及多數(shù)蟲體集合而呈菊花形的排列。 2、中華白蛉Phlebotomus Chinensis：約為蚊子的1／3大小，駝背狀，全身密生細(xì)毛，灰黃色(詳見教材白蛉部分)。 作業(yè)： 以彩色筆繪圖，無鞭毛體(利杜體)，標(biāo)明結(jié)構(gòu)。 思考題： 診斷利什曼病應(yīng)從那些器官組織取材?怎樣識(shí)別涂片中的無鞭毛體? 實(shí)驗(yàn)四十八 藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(Giardia lamblia) 目的要求： 觀察藍(lán)氏賈第鞭毛蟲的滋養(yǎng)體和包囊。 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容： 一、自學(xué)標(biāo)本： 包囊：碘液染色(方法見阿米巴實(shí)驗(yàn)技術(shù)操作)，低倍鏡找到后，高倍鏡下觀察其大小，活意形狀，軸柱，鞭毛及核的數(shù)目等。 二、示教標(biāo)本： 1、滋養(yǎng)體(吉氏染色，油鏡觀察)：注意大小，形態(tài)，核和鞭毛數(shù)目等構(gòu)造。 2、包囊(鐵蘇木素染色，油鏡觀察)：注意大小，形狀，軸柱，鞭毛及核的數(shù)目。 作業(yè)：繪藍(lán)氏賈第鞭毛蟲包囊圖(碘染)，并標(biāo)明結(jié)構(gòu)。 思考題： 藍(lán)氏賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體和包囊的形態(tài)特征有哪些? 實(shí)驗(yàn)四十九 陰道毛滴蟲（Trichomonas Vaginalis) 目的要求：認(rèn)識(shí)陰道毛滴蟲滋養(yǎng)體的形態(tài)及活動(dòng)特點(diǎn)。 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容： 一、自學(xué)標(biāo)本： 陰道毛滴蟲滋養(yǎng)體(吉氏染色或鐵蘇木素染色標(biāo)本)：油鏡下觀察，可見蟲體的構(gòu)造。 二、示教標(biāo)本 1、活的陰道毛滴蟲滋養(yǎng)體：高倍鏡下觀察，在懸滴液內(nèi)可以看到梨狀的透明蟲體，運(yùn)動(dòng)較活潑，前鞭毛不時(shí)地在擺動(dòng)。注意其運(yùn)動(dòng)情況，因在臨床檢驗(yàn)多觀察此種活標(biāo)本。 2、陰道毛滴蟲滋養(yǎng)體，吉氏染色或鐵蘇木素染色標(biāo)本。 作業(yè)： 繪陰道毛滴蟲滋養(yǎng)體圖，并標(biāo)明結(jié)構(gòu) 思考題： 1滴蟲性陰道炎的發(fā)病原因是什么? 2檢查陰道毛滴蟲的方法有哪幾種?
實(shí)驗(yàn)五十 瘧原蟲(Plasmodium spp) 目的要求： 掌握間日瘧原蟲和惡性瘧原蟲在人體紅細(xì)胞內(nèi)的各期形態(tài)。 掌握薄血膜的推片，染色(用吉氏或瑞氏染液染色)操作 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容： 一、自學(xué)標(biāo)本： 間日瘧原蟲薄血片(吉氏染色)：觀察方法：將有血膜的一面朝上，置于低倍鏡下，在血膜末梢紅細(xì)胞分布均勻處加鏡油一滴，使油鏡頭浸入油中；調(diào)節(jié)光亮度取得較強(qiáng)的光線；慢慢旋轉(zhuǎn)螺旋細(xì)調(diào)節(jié)，看清紅細(xì)胞后，按順序觀察。在紅細(xì)胞內(nèi)找瘧原蟲，一般在環(huán)狀體期以后，被寄生的紅細(xì)胞開始逐漸漲大，褪色，而且出現(xiàn)紅色薛氏小點(diǎn)。 (1)環(huán)狀體：注意大小，細(xì)胞質(zhì)與核的特點(diǎn)。 (2)大滋養(yǎng)體：注意蟲體增大，細(xì)胞質(zhì)和核的變化，有否瘧色素。 (3)未成熟裂殖體：注意蟲體變化，細(xì)胞質(zhì)特點(diǎn)，核的數(shù)目，瘧色素分布。 (4)成熟裂殖體：注意核分裂數(shù)目，細(xì)胞質(zhì)是否已隨之分裂，裂殖子排列情況，瘧色素分布情況。 注意事項(xiàng)： 1、瘧原蟲甚小，且在紅細(xì)胞內(nèi)，受感染紅細(xì)胞的比例也少，一般被間日瘧原蟲侵襲的紅細(xì)胞不超過1%，故需耐心地查找。 2、在油鏡下尋找與觀察蟲體形態(tài)時(shí)，滴油不可過多，以免損壞鏡頭與標(biāo)本。 3、注意染料渣質(zhì)與瘧原蟲的區(qū)別：瘧原蟲必須具備紅色的核質(zhì)部分和藍(lán)色的細(xì)胞質(zhì)部分，除環(huán)狀體外還可見瘧色素，染料渣則無上述特點(diǎn)。 4、注意大滋養(yǎng)體與配子體的區(qū)別。 5、淋巴細(xì)胞與瘧原蟲的區(qū)別：淋巴細(xì)胞的細(xì)胞核大多數(shù)是圓形，核大，有顯著的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而淺藍(lán)色的胞質(zhì)很少，無瘧色素。 二、示教標(biāo)本 1、薄血膜中間日瘧原蟲紅細(xì)胞內(nèi)各期(環(huán)狀體、大滋養(yǎng)體、成熟或未成熟裂殖體、雌或雄配子體)(油鏡)。 2、薄血膜中惡性瘧原蟲紅細(xì)胞內(nèi)的環(huán)狀體、雌或雄配子體(油鏡)。 3、子孢子 三、操作 薄血膜的制作及染色 1、取血 小鼠：將伯氏瘧原蟲(Plasmodium berghei)保種的小白鼠的尾部末端剪去，將血滴置于載玻片一端。 2、推片和染色 1)取邊緣平滑的另一載玻片作推片，以左手持載玻片的兩端，右手持推片中段兩側(cè)，將推片一端的邊緣置于血滴上，使血液沿推片端邊緣展開。 2)使兩玻片呈30—45度角，將推片向另一端推動(dòng)，推成均勻的薄血膜。血量適度、推的方向一致、用力均勻是推片成功的關(guān)鍵。放置待干后，用蠟筆在血膜兩端劃線以防染液外溢。 3)用吸管吸取瑞氏(Wright)染液，滴5—10滴于血膜上，使其覆蓋全部血膜。 4)經(jīng)30秒鐘后，滴加等量的緩沖液，使之與染液混勻。 靜置染色5—10分鐘后(注意不使染液干燥)，用清水輕輕將染液沖去。沖洗前切勿先傾去染液，以免染料顆粒沉著。 5)血片斜置，待干后用油鏡觀察。 3、觀察效果 好的標(biāo)本在油鏡下觀察可見到紅細(xì)胞平鋪，無重迭現(xiàn)象。白細(xì)胞核呈紫藍(lán)色，血膜上無染料殘?jiān)林砻魅旧己�。本次�?shí)驗(yàn)經(jīng)染色的鼠血薄血膜中鼠瘧蟲數(shù)量多，被寄生的紅細(xì)胞明顯脹大，常見紅細(xì)胞內(nèi)有多個(gè)瘧原蟲寄生，瘧原蟲細(xì)胞質(zhì)呈藍(lán)色，核為紅色。 4、注意事項(xiàng) 1)載玻片應(yīng)潔凈無油污，以免血膜上產(chǎn)生空泡樣的空白區(qū)。 2)推片的邊緣要平整光滑，推力要均勻，中途不能停頓，以免血膜厚薄不勻。 3)涂成的血膜讓其自然干燥，切勿加熱或曝曬，以免影響染色效果。 4)加緩沖液時(shí)要充分混勻，染色后用流水緩慢沖去染液，避免染料殘?jiān)林谘ど�。厚血膜制作：詳見教材�?shí)驗(yàn)技術(shù)篇附：厚薄血膜的優(yōu)缺點(diǎn)： 用薄血膜觀察瘧原蟲，可保持完整的紅細(xì)胞，有助于鑒別蟲種，但瘧原蟲數(shù)量較少，需細(xì)心尋找。厚血膜取血量多，蟲體集中，檢出率高，但溶血后的紅細(xì)胞失去完整形態(tài)，只剩下瘧原蟲和瘧色素，無經(jīng)驗(yàn)者不易識(shí)別。故為了取長(zhǎng)補(bǔ)短，在流行病學(xué)調(diào)查時(shí)，一般采用在同一張玻片上作厚薄兩種血膜。 作業(yè)： 以彩色筆繪間日瘧原蟲紅內(nèi)期的各期形態(tài)圖，并注明結(jié)構(gòu)。 思考題： 1、瘧原蟲的基本構(gòu)造有哪些?紅內(nèi)期有哪些形態(tài)? 2、間日瘧原蟲紅內(nèi)期各期的形態(tài)特征有哪些? 3、怎樣做好厚、薄血膜?兩種血膜查瘧原蟲各有哪些優(yōu)缺點(diǎn)?用瑞氏或吉氏染色法各應(yīng)注意什么事情?為什么? 5 ...
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