致畸作用是發(fā)育毒性中最重要的一種表現,所以外來化合物發(fā)育毒性的評定,主要是通過致畸試驗。在致畸試驗中除可觀察到出生幼仔畸形外,也可同時發(fā)現生長發(fā)育遲緩和胚胎致死。傳統(tǒng)常規(guī)致畸試驗是評定外來化合物是否具有致畸作用的標準方法,多年來很多國家和機構都采用和推薦這一方法。 (一)傳統(tǒng)常規(guī)致畸試驗(致畸試驗) 1.動物選擇 致畸試驗的動物選擇,除參照毒性試驗中選擇動物的一般原則,即食性和對受試物代謝過程與人類接近,體型小,馴服,容易飼養(yǎng)和繁殖及價廉外,還應特別注意妊娠過程較短、每窩產仔數較多和胎盤構造及厚度與人類接近等特點。 根據上述原則綜合考慮,致畸試驗可選用二種哺乳動物,一般首先考慮大鼠,此外可采用小鼠或家免。大鼠受孕率高,每窩產仔8~10只,易于得到足夠標本數;而且經驗證明,大鼠對大多數外來化合物代謝過程,基本與人類近似,故可首先考慮。但大鼠對一般外來化合物代謝速度,往往高于小鼠和家兔,以致對化學致畸物耐受性強、易感性低,有時出現假陰性。大鼠在器官發(fā)生期初期,其胎盤具有卵黃囊,稱為卵黃囊胎盤,在器官發(fā)生期后期,將轉變?yōu)榻q膜尿囊胎盤,有些外來化合物,例如錐蟲藍可以干擾通過卵黃囊胎盤對胚胎的正常營養(yǎng)過程,并因此致畸,出現陽性結果;而人類胎盤不具有卵黃囊胎盤階段,不存在同樣問題,所以有時此種結果對人類為假陽性。 小鼠自然畸形發(fā)生率較大鼠高,但低于家兔,對形成腭裂的致畸物更較敏感。家兔為草食動物,與人類代謝功能差異較大,妊娠期不夠恒定,有時延長至36天,自然畸形發(fā)生率也較高。 2.劑量分組 由于致畸作用的劑量效應(反應)關系曲線較為陡峭,斜率較大,最大無作用劑量與引起胚胎大量死亡以及母體中毒死亡的劑量極為接近。因此在確定劑量時,一方面要求找出最大無作用劑量以及致畸閾劑量;同時還要保持母體生育能力,不致大批流產和過多胚胎死亡;較多母體死亡也應避免。 一般應先進行預試,預試的目的是找出引起母體中毒的劑量。 根據預試結果可以確定正式試驗劑量。應最少設3個劑量組,另設對照組。原則上最高劑量組,可以引起母體輕度中毒,即進食量減少、體重減輕、死亡不超過10%。最低劑量組不應觀察到任何中毒癥狀;中間劑量組可以允許母體出現某些極輕微中毒癥狀。其劑量與高劑量和低劑量成等比級數關系。 一般最高劑量不超過LD50的1/5~1/3,低劑量可為1/100~1/30。這一原則在預試中也可試用。如已掌握或能估計人體實際接觸量,也可將實際接觸量作為低劑量,并以其10倍左右為最高劑量。凡急性毒性較強的受試物,所采用劑量應稍低,反之可較高。也有人以亞慢性毒性試驗的最大無作用劑量為高劑量,并以其1/30為低劑量,可供參考。 每組動物大鼠或小鼠為12~20只,家兔8~12只,狗等大動物3~4只。在一般常規(guī)試驗中,除設有3個劑量組和一個對照組外,如受試物溶于某種溶劑或介質中給予動物,則另設溶劑對照組。有時為了更好地驗證試驗結果,另設陽性對照組,按大鼠每kg體重15 000IU維生素A劑量,或將每ml含50 000IU維生素A的濃魚肝油,按每100g體重1 ml劑量給大鼠灌胃。此外敵枯雙、五氯酚鈉等也可采用。 3.動物交配處理 將性成熟雌雄動物按雌雄l:1或2:1比例同籠交配。每日將已確定受孕雌鼠隨機分入各劑量組和對照組。確定受孕方法是陰栓檢查或陰道涂片精子檢查。出現陰栓或精子之日即為受孕0日,也有人作為第1日。準確確定受孕日對精確掌握動物接觸受試物時間、最后處死動物及確定進行檢查的日期非常重要。 由于致畸作用有極為明確的敏感期,應精確掌握動物接觸受試物的時間,必須在器官發(fā)生期。如提前在著床前接觸,將影響受精卵的著床。如在胚胎發(fā)育的最初階段,例如裂卵期和囊胚期接觸受試物,往往可使胚胎死亡,不能造成畸形。如在器官發(fā)生期以后接觸受試物,則各種器官已發(fā)育成熟,致畸作用不易表現。只有器官發(fā)生期的胚胎,對致畸物最為敏感,易于出現畸形。 大鼠和小鼠一般可自受孕后第5天開始給予受試物,每日一次,持續(xù)到第15天。如擬深入研究何種器官對受試物更為易感,則應在上述期間將受試物每日分別給予一批動物,每批動物只接觸受試物一次,最后可以根據畸形出現的情況,確定受試物的主要靶器官。 接觸受試物的方式與途徑應與人體實際接觸情況一致,一般多經口給予。也可采用灌胃方式,以保證劑量準確,效果較混入飼料喂給為好。在特殊情況下,也可采用腹腔注射法,效果與經口近似。 試驗期間每2~3天稱取母鼠體重。一方面可根據體重增長,隨時調整給予受試物的劑量,同時也可觀察受孕動物的妊娠情況和胚胎發(fā)育情況。受孕動物的體重如持續(xù)增長,則表示妊娠過程及胚胎發(fā)育正常;如體重停止增長或下降,可能由于受試物的毒性作用或母體的其它原因,引起胚胎死亡或流產。 4.胎仔檢查 自然分娩前1~2日將受孕動物處死,剖腹取出子宮及活產胎仔,并另行記錄死胎及吸收胎。一般大鼠在受孕后第19~20天,小鼠第18~19天,家兔在第29天。 活產胎仔取出后,先檢查性別,逐只稱重,并按窩計算平均體重,然后由下列幾方面進行畸形檢查:①外觀畸形肉眼檢查,例如露腦;②肉眼檢查內臟及軟組織畸形,例如腭裂;③骨骼畸形檢查,例如顱頂骨缺損,分叉肋等;螜z查只限活產胎仔。 以上檢查只能檢出結構與形態(tài)異常的畸形,不能檢出可能發(fā)生的生化功能或神經行為缺陷。因此有人主張將試驗雌鼠保留1/4左右,待其自然分娩,并將出生幼仔飼養(yǎng)觀察,至少到斷奶,以便檢查可能存在的先天缺陷和生理功能異常。 5.結果評定 在致畸試驗結果評定時,主要計算畸胎總數和畸形總數。計算畸胎總數時,每一活產幼仔出現一種或一種以上畸形均作為一個畸胎。計算畸形總數時,在同一幼仔每出現一種畸形,即作為一個畸形;如出現二種或二個畸形,則作為二個畸形計,并依此類推。計算時還要對劑量效應(反應)關系加以分析。更重要的是按下列指標將各劑量組與對照組結果進行比較。 (1)活產幼仔平均畸形出現數: 即根據出現的畸形總數,計算每個活產幼仔出現的畸形平均數。對較為重要的畸形,還可分別單獨進行計數。 畸形總數 活產幼仔平均畸形出現數= ——————————— 活產幼仔總數 (2)畸形出現率:即作為畸胎的幼仔在活產幼仔總數中所占的百分率。 出現畸形的胎仔總數 畸胎出現率= ——————————— × 100% 活產胎仔總數 (3)母體畸胎出現率:即出現畸形胎仔的母體在妊娠母體總數中所占的百分率。計算出現畸形母體數時,同一母體無論出現多少畸形胎仔或多少種畸形,一律按一個出現畸胎的母體計算。 出現畸胎的母體數 母體畸胎出現率= ———————————× 100% 妊娠母體數 6.致畸物以及發(fā)育毒性作用物危險度評定 (1)歐共體(EEC)和經濟合作與發(fā)展組織(OECD)建議的致畸物分級標準。主要根據動物試驗和人群調查資料,具體分級標準: 1級, 已確定人類母體接觸后可引起子代先天性缺陷; 2A級,對動物肯定致畸,但對人類致畸作用尚未確定因果關系; 2B級,動物試驗結果肯定致畸,但無人類致畸資料; 3 級,尚無結論性肯定致畸證據或資料不足; 4級, 動物試驗陰性,人群中調查結果未發(fā)現致畸 (2)致畸指數: 母體LD50與胎仔最小致畸作用劑量之比,即母體LD50/胎仔最小致畸作用劑量。這一比值愈大,致畸作用愈強,一般認為比值10以下者,不具致畸作用,10~100具致畸作用,100以上致畸作用強烈。 (3)相對致畸指數(RTI):成年動物最小致死劑量(LD01)與引起5%活產胎仔出現畸形的劑量(tD05)之比值,即LD01/ LD05。 (4)母體毒性與發(fā)育毒性比值:或稱成年毒性與發(fā)育毒性比值,即對母體最低損害作用劑量(A)與胎仔最低損害作用劑景(D)之比(A/D)。一般認為A/D比值為3或3以上者,則具有發(fā)育毒性危險性。比值越大,危險性越高,3以下者,相對危險性較低或不具危險性。在一般情況下,大多數化合物A/D比值均在3以下,以及1~2范圍內。關于母體和胎仔最低損害作用的具體表現,在母體主要為體重增長減少,出現某些臨床癥狀以及死亡,對胎仔則為致畸以及其它發(fā)育毒性表現。 |