全球60 億人口中, 約1/2 人口生活在乙肝病毒(HBV ) 高流行區(qū), 約20 億人證明有HBV 感染, 3～4 億人為HBV 慢性感染, 每年約有100 萬人死于HBV 感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細胞癌(HCC)。2005 年12 月10 日中華醫(yī)學會肝病學分會和中華醫(yī)學會感染學分會, 中國肝炎防治基金會聯(lián)合發(fā)布我國首部《慢性乙型肝炎防治指南》, 作為診治乙肝規(guī)范性的行動指南。目前國內(nèi)檢測HBV感染血清學標志物應用較多的仍是ELISA 方法。其有以下缺點: 無法定量、靈敏度低, 由檢測原理帶來的前帶現(xiàn)象無法解決, 易污染, 無法完成HBV 感染的動態(tài)觀察以及低水平HBV 感染指標檢測; 免疫膠體金檢測技術可大大縮短檢測時間, 不需要特殊設備, 操作簡單, 但靈敏度欠佳, 假陽性問題難以克服。
隨著科學技術的飛速發(fā)展, 先進診斷技術不斷出現(xiàn), 時間分辨熒光免疫分析技術(TRF IA ) 是近年發(fā)展起來的無環(huán)境污染的高靈敏度免疫標記檢測技術。乙肝作為常見病毒感染性疾病之一, 臨床上常用ELISA 法定性檢測乙肝病毒血清學標志物作為診斷HBV 是否感染的依據(jù), 由于鉤狀效應和敏感性的原因, 常造成HBV 感染的漏診。臨床實踐表明, TRF IA 法定量檢測乙肝病毒五項血清標志物對乙肝診治的臨床應用越來越顯示出其優(yōu)越性。
1.材料和方法
1.1 標本來源 收集2004年6 月～2005年9月在我院門診和病房就診患者血清標本920份,并分別定量和定性檢測HBV 血清免疫學標志的全部結(jié)果。所有患者均采集靜脈血,于當日分離血清, -70℃保存, 并于1 w 內(nèi)檢測。
1.2 試劑 上海新波生物技術有限公司生產(chǎn)的HBsAg, 抗-HBs, HBeAg, 抗-HBe 和抗-HBc 定量檢測試劑盒, 批號為20050720; 北京萬泰有限公司生產(chǎn)的ELISA 法定性試劑盒, 批號為B20050101;衛(wèi)生部臨檢中心提供的乙肝病毒血清學標志物質(zhì)控品, 批號20050521。
1.3 儀器 Anytest2000 型時間分辨熒光免疫分析儀,DYNEX-MRX 型酶標儀。
1.4 方法 乙肝病毒血清學標志物定量的TRF IA 法和定性的ELISA 法檢測, 均嚴格按照試劑盒各自說明書和《全國臨床檢驗操作規(guī)程》中的要求, 兩種方法同時分別對不同濃度的標準品和臨床標本進行檢測。
1.5 結(jié)果判定 ELISA 法定性結(jié)果參照試劑說明書中的判定方法, 經(jīng)過本室嚴格檢測, TRF IA 法檢測的不同濃度標準品對應ELISA 法定性檢測的結(jié)果為: 以HBsAg≥1.0 ng/ml, 抗-HB s≥10 mIU/ml, HBeAg ≥0.5 NCU/ml, 抗-HBe≥4.0 NCU/ml, 抗-HBc≥0.6 NCU/ml 判定為陽性, 反之為陰性, 見表1。
1.6 統(tǒng)計學分析 用Excel管理數(shù)據(jù)庫和SPSS11.0 軟件統(tǒng)計分析, 方法學間數(shù)據(jù)比較用χ2檢驗。
2.結(jié)果
2.1 分別用TRF IA 法和ELISA 法對920 份臨床血清標本進行檢測, 參照表1 中判定乙肝病毒五項血清學標志物定量的陰陽性的方法,所有標本均經(jīng)AXSYM免疫分析儀微粒子酶免分析法檢測HBV感染血清學標志物驗證(此驗證方法目前是公認的診斷HBV 感染的血清學方法) , 結(jié)果對比如表2。
2.2 TRF IA法的敏感性: 對0.2 ng/ml HBsAg,10 mIU/ml 抗-HBs, 0. 05 NCU/ml HBeAg, 2 NCU/ml 抗-HBe和0.2 NCU/ml 抗-HBc標準樣品TRF IA法均可檢出, 而ELISA法除抗-HBs為±外, 其余均未檢出。
3.討論
傳統(tǒng)的ELISA 方法對乙肝兩對半血清標志物定性測定, 只能判斷其陰陽性, 無法得知其真正的濃度, 給臨床診斷和治療帶來許多不便。而HBV 血清標志物定量檢測能較為準確地反映其血清中的含量, 可以間接反映體內(nèi)HBV 復制活躍程度, 對臨床藥物療效評價具有重要意義。兩對半定量檢測結(jié)果的有效性在檢測的過程中直接進行了標準量化質(zhì)控, 分高中低及三個定值質(zhì)控品; 兩對半定性檢測的室內(nèi)質(zhì)控, ELISA 只能間接進行質(zhì)控, 分陰陽性質(zhì)控品, 免疫膠體金檢測則不能進行嚴格的室內(nèi)質(zhì)控, 從而來保證檢測結(jié)果的有效性和溯源性。
在急性乙肝早期能及早檢出HBsAg, 確證HBV感染, 縮短窗口期; 其次
, 可發(fā)現(xiàn)低濃度HBsAg攜帶者; 在部分慢性乙肝患者中, 由于機體缺乏對HBV 包膜蛋白的免疫應答, HBsAg 表達較低, 酶標檢測可出現(xiàn)HBsAg和抗-HBs 均陰性的情況, 定量檢測則可避免這些情況的發(fā)生, 為正確判斷病情提供依據(jù)。定量分析HBsAg 和抗-HBs 的濃度變化, 可預見急性乙肝是否處于恢復期。如HBsAg 濃度降低, 抗-HBs 濃度逐漸升高, 可說明病情正往恢復期發(fā)展; 反之,HBsAg 濃度處于較高水平或上升趨勢, 而抗-HBs一直處于較低水平, 則易發(fā)展為慢性乙肝或病毒攜帶者。定量分析HBsAg和抗-HBe的濃度變化, 可反映病情變化和治療效果。定量檢測能明確HBsAg 向抗-HBe 轉(zhuǎn)換的時期, 即表現(xiàn)為HBsAg 濃度下降和抗-HBe 升高的過程。高濃度的HBsAg 還可間接提示病毒處于高復制狀態(tài), 具有較高的傳染性; 高濃度的抗-HBe 一方面提示病情好轉(zhuǎn), 而在某些時候(如肝功能指標很差) 則可能與quanxiangyun.cn肝壞死、肝硬化、肝癌有關; 抗-HBc 濃度的高低可反映病毒感染的狀態(tài); 高濃度的抗-HBc提示乙肝急性感染, 恢復期濃度降低; 慢性乙肝呈抗-HBc持續(xù)高濃度; 而低濃度的抗-HBc 一般為恢復期或既往感染。對920份臨床血清檢測結(jié)果進行比較, TRF IA 法檢測乙肝病毒五項血清學標志物的靈敏度均高于ELISA 法, 并具有較好的重復性, 檢測結(jié)果顯示, 兩種方法HBeA g, 抗-HBs 結(jié)果一致率較好, 其余3 個指標, TRF IA 法檢測陽性率均大于ELISA 法, 具有顯著性差異(見表2)。TRF IA 法檢測較ELISA 法檢測更敏感, 可減少低濃度HBsAg 感染病人的漏診, 以及隱匿性慢性乙型肝炎的漏診。TRF IA 檢測HBsAg 靈敏度可達012 ng/ml, 而ELASA 檢測的靈敏度是2 ng/ml, 極大地提高了檢測的靈敏度。
血中HBV-DNA 的存在是HBV 感染最為直接、靈敏和特異的指標, 但我們不能因此而斷言病毒基因檢測可取代HBV 血清標志物定量檢測,基因檢測所顯示的優(yōu)越性也恰恰是它的缺陷之所在,我們只能通過它來判斷病原體的有無和量的多少,至于病原體進入體內(nèi)之后的反應(即感染后的免疫應答) , 是判斷被感染者病情、治療反應、預后、以及流行病學調(diào)查的重要依據(jù)�？陀^地講, 基因檢測和免疫學定量檢測在目前應當互補共存, 絕大多數(shù)情況下兩者缺一不可。因為乙肝HBsAg 是乙肝病毒的外殼物質(zhì), 本身沒有傳染性, 它的陽性往往提示有完整的病毒顆粒存在, 國外報道HBsAg 陽性患者檢測HBV-DNA 陽性率52%, 但HBsAg 單陽性中, HBV-DNA 全為陰性, 這說明血清標志物僅有HBsAg 陽性的患者體內(nèi)病毒數(shù)量比較少, 復制水平也很低不具傳染性, 但也有報道稱, HBsAg的滴度與HBV-DNA 定量檢測結(jié)果明顯呈正相關。陽性組HBV-DNA 全陰性, 可能是因為HBsAg 滴度低, 當?shù)味壬邥r, 常伴有HBeAg, 抗-HBe, 抗-HBc等血清標志物的出現(xiàn)。HBeAg 產(chǎn)生于病毒內(nèi)部, 與Dane 顆粒呈正相關, 可分泌至血液中, e 抗原陽性是HBV 復制活躍的血清學指標, 血清HBeAg 陽性說明傳染性強, 國外報道HBeAg 陽性HBV-DNA陽性率為94%～100%, 當血清HBeAg 轉(zhuǎn)陰后, 可出現(xiàn)抗-HBe, 抗-HBe 陽性說明病毒復制減少, 傳染性弱, 但并非沒有傳染性。小三陽HBV-DNA 陽性率低于大三陽, 但仍高于HBsAg 單陽性組, 抗-HBc-IgG 與Dane 顆粒無關,提示為既往感染, 無傳染性。單純性的抗-HBc-IgG陽性時的HBV-DNA 陽性率多數(shù)報道認為在1% 以下。但是抗-HBc 是HBV 感染后血清中最早出現(xiàn)HBV 標志性抗體, 在HBV 感染的“窗口期”, 抗-HBc 往往是唯一可檢測出的HBV 血清標志物,ELISA 定性檢測的敏感性、特異性、陽性檢出率都不如TRF IA 法定量檢測。另外乙肝患者恢復期和機體開始產(chǎn)生免疫力時, 血清中可有多種抗體陽性, 抗-HBs, 抗-HBe, 抗-HBc 三抗體之間可出現(xiàn)多種組合, HBsAg 陰性并不能排除HBV 感染, 有的血清仍有一定的傳染性。雖然對HBsAg 陰性持有不同的解釋, 如: ①HBsAg 含量太少, 現(xiàn)在檢測技術無法檢出; ②HBV 感染而HBsAg 陰性可為乙肝的一個亞型; ③HBsAg
與檢驗醫(yī)學網(wǎng)抗-HBs 結(jié)合成復合物,使其在血中難以檢測出等諸多影響因素。但是乙肝血清學標志物定量是利用時間分辨熒光定量的方法進行的, 大大地提高了檢測水平。
總之, 同人們從接受腫瘤標志物定性到定量的過渡一樣, 隨著現(xiàn)代乙肝臨床診治的需要, 乙肝血清學標志物定量檢測的臨床應用價值將顯現(xiàn)出來。
