【質量鑒定】
制備的PAP復合物應檢測酶和抗體的含量，以鑒定PAP復合物的質量。常用分光光度計檢測PAP的復合物在280nm（IgG的最大吸收波長)和400nm（HRP的最大吸收波長)的光密度值（OD值)，按下式計算IgG和HRP的含量：
一般HRP/抗HRP的克分子比達1.9時，可分裝冷藏于-85℃冰箱，據報告如此冷藏的PAP復合物可保留14年之久，活性無改變。但稀釋后的PAP復合物不穩(wěn)定，4℃可保存2～3周。最好臨用前配制。
【PAP復合物的特征】
PAP復合物的形成不同于其它抗原抗體反應，在抗原稍過量時，所有的抗HRP抗體均參與形成可溶性PAP復合物，僅殘留少許游離的HRP，而大多數抗原抗體反應需要抗原絕對過量才能形成可溶性復合物。PAP復合物的形狀相當穩(wěn)定，不受抗原量的影響，無論最初加入的抗原抗體過量與否，最終形成的PAP復合物其HRP/抗HRP之比絕大部分為3：2。應用離心沉降、液相擴散等方法分析表明：PAP復合物沉降系數為11.5s,分子量為400～430kD，由此可推算出酶與抗體之比為3：2，即每個PAP生命物由3個HRP分子和2個抗HRP抗體組成，呈五角形結構，3個角為HRP，另兩個角為抗HRP抗體。采用H2O2-DAB染色，電鏡下已經觀察到PAP復合物五角形環(huán)狀結構，直徑平均21nm 。這種結構異常穩(wěn)定。據報告PAP復合物的抗HRP抗體與HRP結合常數為108，在此可溶性復合物中，即使存在少量游離HRP，亦不影響其穩(wěn)定性。
2．PAP染色原理及步驟
（1)原理：與酶橋法相似，都是借助橋抗體將酶連結在與組織抗原結合的第一抗體上，所不同的是PAP法將酶橋法的步驟3、4合并為1，用PAP復合物代替，即第三步用PAP復合物孵育切片，故稱PAP法。PAP復合物中的抗HRP抗體和第一抗體為相同種屬動物的IgG，所以橋抗體能夠作為“橋”將PAP復合物連結在第一抗體上。醫(yī)學全在線www.med126.com
�。�2)染色步驟：主要步驟與酶橋法相似，如圖4-5。
①切片準備及第一抗體孵育前處理同間接法；切片與特異性第一抗體孵育同酶橋法。
�、谟眠^量的橋抗體孵育，作用同酶橋法。
圖4-5 PAP法主要染色步驟
�、塾秒x體制得的PAP復合物（1：30～300稀釋)孵育1～1.5h（室溫)，使其被橋抗體連結在第一抗體上。亦可用ALP抗ALP復合物代替。
�、茱@色觀察等同間接法。
3．PAP法的評價 PAP法應用比較廣泛，特別是近幾年，PAP、ABC等試劑盒商品化，在科研和臨床病理診斷等中有著廣闊的前景。其主要特征和注意事項如下：
�。�1)抗體活性高：非標記抗體酶法最大限度地保存了抗體活性，因為在所有的反應過程中，任何抗體均未被酶連結，避免了標記過程（共價鍵連結)對抗體活性的損害。
�。�2)靈敏度高：靈敏度是指ICC方法所能發(fā)現最少數量抗原而言。從理論上講，PAP法應該較間接法敏感2倍以上，因為酶標抗體法中，酶與抗體為1：1標記，而PAP復合物含有3個HRP分子。假設一個第一抗體同一個酶標抗體/PAP復合物結合，則被連結于抗原部位的酶分子數量不同，所以PAP法應較敏感。我們知道組織切片抗原的含量是未知的，所以不能直接在切片上檢測方法的敏感度；但可以假設相鄰切片抗原濃度相對恒定，采用相鄰切片染色，以產生特異性染色所用的第一抗體最低濃度作為方法的敏感度，用信噪比（Signal/moise,S/N)表示。據此，Sternberger(1979)認為PAP法較間接法敏感20～25倍，可進一步稀釋第一抗體，以節(jié) 省其用量。但實際上PAP法與間接法之間的差異并非如此明顯。筆者在實驗中注意到，PAP顯示陽性的抗原，相同的稀釋倍數的第一抗體在間接法中亦呈陽性反應，而時間陰性時，PAP法亦為陰性。其原因尚不清楚，可能與橋抗體和第一抗體結合時，“剩余”（游離)的Fab段少，PAP復合物被連結的相應減少有關。另外 ，PAP復合物分子量較大（400KD),冰凍切片時，對組織穿透性遠不如酶標抗體（分子量90～180kDa)，所以不適于免疫電鏡的標本制作。
