（四) Km和Vmax的求解方法
1、 雙倒數(shù)作圖法
要從實驗數(shù)據所得到的v-[S]曲線來直接決定Vmax是很困難的，也不易求出Km值。
由米式方程兩邊取倒數(shù)：
將實驗所得的初速度數(shù)據v和[S]取倒數(shù)，得各種1/v和1/[S]值，將1/v對1/[S]作圖，得
P250 圖4-6
上圖[S]范圍在0.330—2.0Km，最適。
若[S]范圍在3.3—20 Km ，直線斜率太小。
若[S]范圍在0.033––0.2 Km ，直線斜率太大。
如當Km=1×10-5mol/L時，實驗所取底物濃度范圍應在0.33×10-5－2.0×10-5mol/L。
一般選底物濃度應考慮能否得到1/[S]的常數(shù)增量。
如當選[S]為1.01、1.11、1.25、1.42、1.66、2.0、2.5、3.33、5.0、10時
1/[S]為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0是常數(shù)增量。
反之，若選[S]為常數(shù)增量1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、10時，
1/[S]為0.1、0.111、0.125、0.5、1.0，是非常數(shù)增量，點多集中在1/v軸附近。
2、 V—V/[S]作圖法
P250 圖4-7
三、 多底物的酶促反應
前面討論的米氏方程（推導米氏方程時用的是單底物)，適用于單底物酶促反應，如異構、水解及大部分裂合反應，不適用于多底物反應。
A、B、C表示底物，按照底物與酶的結合順序，產物則按它們從酶產復合物中釋放次序分別用P、Q、R表示。
雙底物酶促反應已知有三種機理
1、 有序順序反應機理
底物A、B與酶結合的順序是一定的，產物P、Q的釋放順序也是一定的。
P251
舉例：P251 乙醇脫氫酶
2、 隨機順序反應機理
底物A、B與酶結合的順序是隨機的，產物P、Q的釋放順序也是隨機的。
P252
如糖原磷酸化酶
3、 乒乓反應機理
先結合第一個底物A，釋放第一個產物P，酶的構象發(fā)生變化，結合第二個底物B，釋放第二個產物Q。
P252
舉例： 谷丙轉氨酶
四、 pH對酶促反應速度的影響
1. pH影響酶活力的因素
①影響酶蛋白構象，過酸或過堿會使酶變性。醫(yī)學全在線quanxiangyun.cn
②影響酶和底物分子解離狀態(tài)，尤其是酶活性中心的解離狀態(tài)，最終影響ES形成。
③影響酶和底物分子中另一些基團解離，這些基團的離子化狀態(tài)影響酶的專一性及活性中心構象。
2．酶的最適pH和穩(wěn)定性pH
最適pH：使酶促反應速度達到最大時的介質pH。
酶在試管反應中的最適pH與它所在細胞中的生理pH不一定完全相同，為什么？
幾種酶的最適pH，見P253表4—6。
穩(wěn)定性pH：在一定pH范圍內，酶不會變性失活，此范圍稱酶的穩(wěn)定性pH。
圖
A．最適pH曲線：最適pH=6.8
B．穩(wěn)定性pH曲線：pH5~8
曲線B：將酶在不同pH下保溫，再調回pH6.8，測定反應速度。
曲線B說明，在pH6.8~8及5~6.8范圍內反應速度的降低，不是由于酶蛋白變性失活造成的，而是由于酶或底物形成了不正常的解離，而在pH ＞8和pH＜5范圍，則是由兩種因素共同作用的結果。
雖然大部分酶的pH—酶活曲線是鐘形，但也有半鐘形甚至直線形。
P254 圖4-9 酶的pH—酶活曲線
五、 溫度對酶促反應速度的影響。
1．最適溫度及影響因素
溫度對酶促反應速度的影響有兩個方面：
①提高溫度，加快反應速度。
②提高溫度，酶變性失活。
這兩種因素共同作用，在小于最適溫度時，前一種因素為主；在大于最適溫度時，后一種因素為主。最適溫度就是這兩種因素綜合作用的結果。
溫度系數(shù)Q10：溫度升高10℃，反應速度與原來的反應速度之比，Q10一般為1~2。
溫血動物的酶，最適溫度35℃—40℃，植物酶最適溫度40℃—50℃，細菌Taq DNA聚合酶70℃。
2．酶的穩(wěn)定性溫度
在某一時間范圍內，酶活性不降低的最高溫度稱該酶的穩(wěn)定性溫度。
酶的穩(wěn)定性溫度有一定的時間限制。
穩(wěn)定性溫度范圍的確定方法：將酶分別在不同溫度下預保溫一定時間，然后回到較低溫度（即酶的熱變性失活作用可忽略的溫度)，測酶活性。
圖
酶濃度高、不純、有底物、抑制劑和保護劑會使穩(wěn)定性溫度增高。
酶的保存：
①液體酶制劑可以利用上述5種因素中的幾種，低溫（幾個月)。
②干粉，可在室溫下放置一段時間，長期保存，應在低溫冰箱中。
六、 酶濃度對酶促反應速度的影響
如果底物濃度足夠大，使酶飽和，則反應速度與酶濃度成正比。
Vmax = K3 [E]
[S]過量且不變時，v∝[E]。
七、 激活劑對酶促反應速度的影響
凡是能提高酶活性的物質，都稱為激活劑。activator
激活劑作用包括兩種情況：
一種是由于激活劑的存在，使一些本來有活性的酶活性進一步提高，這一類激活劑主要是離子或簡單有機化合物。
另一種是激活酶原，無活性→有活性，這一類激活劑可能是離子或蛋白質。
1、 無機離子的激活作用
（1)金屬離子：K+ 、Na+、Mg2+ 、Zn2+、Fe 2+ 、Ca2+
（2)陰離子：cl-、Br -
（3)氫離子
許多金屬離子是酶的輔助因子，是酶的組成成分，參與催化反應中的電子傳遞。
有些金屬離子可與酶分子肽鏈上側鏈基團結合，穩(wěn)定酶分子的活性構象。
有的金屬離子通過生成螯合物，在酶與底物結合中起橋梁作用。
注意：
（1) 無機離子的激活作用具有選擇性，不同的離子激活不同的酶。
（2) 不同離子之間有拮抗作用，如Na+與K+、Mg+與Ca+，但Mg+與Zn+�？商娲�。
（3) 激活劑的濃度要適中，過高往往有抑制作用，1~50mM
2、 簡單有機分子的激活作用
①還原劑（如Cys、還原型谷胱甘肽)能激活某些活性中心含有—SH的酶。
②金屬螯合劑（EDTA)能去除酶中重金屬離子，解除抑制作用。
抑制劑對酶促反應速度的影響
酶是protein ，凡可使酶蛋白變性而引起酶活力喪失的作用稱為酶的失活作用。
抑制作用：使酶活力下降但并不引起酶蛋白變性的作用稱為抑制作用。（不可逆抑制、可逆抑制)
抑制劑（inhibitor)：不引起酶蛋白變性，但能使酶分子上某些必需基團（活性中心上一些基團)發(fā)生變化，引起酶活性下降，甚至喪失，此類物質稱為酶的抑制劑。
研究抑制劑對酶的作用有重大的意義：
（1) 藥物作用機理和抑制劑型藥物的設計與開發(fā)：抗癌藥
（2) 對生物體的代謝途徑進行認為調控，代謝控制發(fā)酵
（3) 研究酶的活性中心的構象及其化學功能基團，不僅可以設計農藥，而且也是酶工程和化學修飾酶、酶工業(yè)的基礎
（一) 不可逆抑制作用（非專性必、專一性)
抑制劑與酶活性中心基團共價結合，使酶的活性下降，無法用透析法除去抑制劑。
1、 非專一性不可逆抑制劑
此類抑制劑可以和一類或幾類基團反應。它們不但能和酶分子中的必需基團作用，同時也能和相應的非必需基團作用。
（1)、 �；瘎�
二異丙基磷酰氟酯（DFP，神經毒氣)和許多有機磷農藥都屬于磷�；瘎�，能與酶活性中心Ser的—OH結合，抑制某些蛋白酶及酯酶。這類化合物的作用機理是強烈地抑制與中樞神經系統(tǒng)有關的乙酰膽堿脂酶，使乙酰膽堿不能分解為乙酰和膽堿。乙酰膽堿的堆積，引起一系列神經中毒癥狀。
Ｐ258 結構式：磷酰化劑與DFP
P259 反應式：磷�；瘎┡c膽堿酯酶形成磷酰化膽堿酯酶
解毒劑：PAM（解磷定)，可以把酶上的磷酸根除去。
（2)、 烷化劑
許多有機汞、有機砷都是烷化劑，可以使酶的巰基烷化
P259 反應式：對氯汞苯甲酸與巰基酶的反應
有機汞、有機砷化合物和重金屬還可以與還原型硫辛酸（人體重要的輔酶)反應
解毒劑：二巰基丙醇
（3)、 氰化物
與含鐵撲啉的酶中的Fe2+結合，阻抑細胞呼吸。
（4)、 重金屬
Ag、Cu、Hg、Cd、Pb能使大多數(shù)酶失活，EDTA可解除。
（5)、 還原劑
以二硫鍵為必需基團的酶，可以被巰基乙醇、二硫蘇糖醇等巰基試劑還原失活。
（6)、 含活潑雙鍵試劑（與—ＳＨ、—ＮＨ２反應)
Ｎ—乙基順丁烯二酰亞胺
圖
（7)、 親電試劑
四硝基甲烷，可使Tyr硝基化。
圖
2、 專一性不可逆抑制
此類抑制劑僅僅和活性部位的有關基團反應。
（1)、 Ks型專一性不可逆抑制劑
Ks型抑制劑不僅具有與底物相似的、可與酶結合的基團，同時還有一個能與酶的其它基團反應的活潑基團。
專一性：抑制劑與酶活性部位某基團形成的非共價絡合物和抑制劑與非活性部位同類基團形成的非共價絡合物之間的解離常數(shù)不同。
舉例：
胰凝乳蛋白酶的Ks型不可逆抑制劑：對一甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲烷（TPCK)與該酶的最佳底物對-甲苯磺酰-L-苯丙氨酸甲酯的結構相似，都含有對-甲苯磺酰-L-苯丙氨�；�，酶通過對這個基團的強親和力，把TPCK誤認為底物而與之結合，形成Ks很小的非共價絡合物。
《酶學》P119
最佳底物 TPCK
-CH2-cl與酶活性部位的一個His-咪唑基距離很近，很易使之烷基化，而非活性部位的咪唑基，由于遠離-CH2-cl，則不被烷基化。
（2)、 Kcat型專一性不可逆抑制劑
這種抑制劑是根據酶的催化過程來設計的，它們與底物類似，既能與酶結合，也能被催化發(fā)生反應，在其分子中具有潛伏反應基團（latent reactive group)，該基團會被酶催化而活化，并立即與酶活性中心某基團進行不可逆結合，使酶受抑制。此種抑制專一性強，又是經酶催化后引起，被稱為自殺性底物。
舉例1：
β-羥基癸酰硫酯脫水酶的Kcat型不可逆抑制劑：CH3(CH2)5-C=C-CH2-CO-S-R
此酶催化的反應：
P260反應式
當有Kcat抑制劑時，此抑制劑被催化生成連丙二烯結構，連丙二烯易與His咪唑反應，使酶失活。
P261反應式
舉例2：
以FMN（黃素單核苷酸)、FAD（黃素腺嘌呤二核苷酸)為輔基的單胺氧化酶的Kcat型不可逆抑制劑；炔類化合物。
迫降靈是一種單胺氧化酶的自殺性底物，是治療高血壓的良藥。
圖
單胺氧化酶能氧化某些血管舒張劑（如組胺)
圖
由于迫降靈能抑制單胺氧化酶，也就能抑制一些血管舒張劑（如組胺)的氧化，因而有降血壓的作用。
Kcat型專一性不可逆抑制劑的專一性很強，近來已設計出多種酶的Kcat逆制劑，在醫(yī)療方面起到很大作用。
（二) 可逆抑制作用 Reversible Inhibition
此類抑制劑與酶蛋白的結合是可逆的，可以用透折法除去抑制劑，恢復酶的活性。
1、 競爭性抑制（Competitive inhibition)
抑制劑與底物競爭酶的活性中心。
競爭性抑制劑具有與底物類似的結構，可與酶形成可逆的EI復合物，阻止底物與酶結合。可以通過增加底物濃度而解除此種抑制。
P258 圖4-11 酶與底物及競爭性、非競爭性抑制劑結合的模型
舉例1：丙二酸抑制琥珀酸脫氫酶
舉例2：磺胺類藥物及其作用機理
磺胺類藥物可以抑制細菌的生長繁殖，治療細菌引起的各種疾病。
磺胺類藥物是對氨基苯磺酰胺或其衍生物，它是對氨基苯甲酸的結構類似物，競爭性抑制二氫葉酸合成酶
P261 結構式：對氨基苯甲酸 對氨基苯磺酰胺 葉酸
磺胺類藥物的藥理（對氨基苯磺酰胺)：
嘌呤核苷酸的合成必需要由四氫葉酸（輔酶)提供一碳單位；四氫葉酸可由二氫葉酸或葉酸轉化而成；二氫葉酸是在二氫葉酸合成酶作用下，利用蝶呤、對氨基苯甲酸及Glu合成。
動物體內的葉酸可從食物中獲取，細菌體內的葉酸只能在二氫葉酸合成酶作用下，利用對氨基苯甲酸合成。
如果動物體內含有大量的對氨基苯磺酰胺，可與對氨基苯甲酸競爭二氫葉酸合成酶的活性中心，抑制細菌二氫葉酸合成。
2、 非競爭性抑制
特點：抑制劑與酶活性中的以外的基團結合，其結構可能與底物無關。
酶可以同時與底物及抑制劑結合，但是，中間產物ESI不能進一步分解為產物，因此，酶的活性降低。顯然，不能通過增加底物的濃度的辦法來消除非競爭性抑制作用。
非競爭性抑制劑多是與酶活性中心之外的巰基可逆結合，包括某些含金屬離子的化合物（Cu2+、Hg2+、Ag+)和EDTA，。
3、 反競爭性抑制
酶只有在與底物結合后，才能與抑制劑結合。E+S→ES+I ≠ P
（三) 可逆抑制作用的動力學
用書上P263-266的方法可推出三種抑制方程。
1、 競爭性抑制：
動力學方程：
競爭性抑制曲線:
P263 圖4-12競爭性抑制曲線
競爭性抑制作用小結：
（1) Vmax不變，Km變大。要達到同一個給定的Vmax分數(shù)，必須要有比無抑制劑時大得多的底物濃度。
（2) 競爭性抑制劑對酶促反應的抑制程度，決定于[I]、[S]、Km和Ki
A. [I]一定，增加[S]，可減少抑制程度。
B. [S]一定，增加[I]，可增加抑制程度（Km’增加)。
C. Ki值較低時，任何給定[I]和[S]，抑制程度都較大，Ki越大，抑制作用越小。
D. [I]=Ki時，所作雙倒數(shù)圖直線的斜率加倍。
E. 在一定[S]、[I]下，Km值愈低，抑制程度愈小。
2、 非競爭性抑制
動力學方程：
相對速度：
抑制分數(shù)：
非競爭抑制曲線：
P265 圖4-13
非競爭性抑制劑可使酶促反應的Vmax降至Vmax/（1+[I]/Ki)，而對Km無影響。它對酶促反應的抑制程度決定于[I]和Ki ，與酶的Km和[S]無關。
3、 反競爭性抑制
動力學方程：
相對速度：
抑制分數(shù)：
P265 圖4-14 反競爭抑制曲線
在反競爭性抑制作用下，Km及Vmax都變小，且Km’<KM&NBSP;&NBSP;
P266 表4-7 小結： 三種可逆抑制作用的酶促反應速度V與Km值
九、 有機介質中的酶促反應（只是一部分酶)
傳統(tǒng)觀點：酶是水溶性生物大分子，只能在水介質中進行催化反應，有機介質會使酶變性。
其實在細胞中，許多生物膜上的酶就是在低極性的微環(huán)境中發(fā)揮催化功能的。
優(yōu)點： ①利于疏水性底物的反應。
②可提高酶的熱穩(wěn)定性，提高催化溫度。
③能催化在水中不能進行的反應。
④可改變反應平衡移動方向。
⑤可控制底物專一性。
⑥防止由水引起的副反應。
⑦可擴大pH值的適應性等等。
1、 有機介質中酶促反應的條件
（1)、 必需水（結合水)
酶催化活性所必需的構象，是由水分子直接或間接地通過氫鍵等非共價相互作用來維持的，因此只有與酶分子緊密結合的單層水分子，對酶的催化活性才是至關重要的。
這緊緊吸附在酶分子表面，維持酶催化活性所必需的最少量的水稱為必需水（或結合水、束縛水)。
酶的活性由必需水決定，而與溶劑里的水含量無關，只要必需水不丟失，其它大部分水即使都被有機溶劑取代，酶仍然保持其催化活性。
因此，可把有機介質中酶促反應理解為宏觀上是在有機介質中，而在微觀上仍是水中的酶促反應。正因如此，才能使用有機介質代替水溶液，進行酶促反應。
一個干燥的酶水合： 吸附水量：
酶分子表面電荷基團： 0-0.07g/g (水/酶)
酶分子表面極性基團： 0.07-0.25g/g
弱極性、非極性基團： 0.25-0.28g/g
表面完全水化，被一層水分子包圍。
酶的必需水含量因酶而異。
脂肪酶：幾個水分子/每個酶分子
胰凝乳蛋白酶：50個水分子/每個酶分子
乙醇脫氫酶：幾百個水分子/每個酶分子
（2)、 對酶的要求
具有對抗有機介質變性的經能力。
（3)、 合適的溶劑及反應體系
（4)、 合適的pH
保證有機介質中酶的微環(huán)境具有最適pH值。酶應從具有最適pH值的緩沖液中凍干或沉淀出來。
2、 有機介質對酶性質的影響
（1)、 穩(wěn)定性
大多數(shù)酶在低水有機介質中比在水介質中更穩(wěn)定。
a. 熱穩(wěn)定性提高
例如：豬胰脂肪酶在醇和酯中進行催化反應，在100℃半衰期長達12h，其活性比25℃時還高幾倍
b. 儲存穩(wěn)定性提高
胰凝乳蛋白酶在20℃時，在水中半衰期只幾天。在辛烷中，可放6個月，仍保持全部活性。
（2)、 活性
有兩類影響 升高活性
降低活性
酶的超活性：高于水溶液中酶活性值的活性。
（3)、 專一性
某些有機溶劑會使某些酶的專一性發(fā)生變化，如脂肪酶在有機介質中有合成肽鍵的功能。星號活力（第二活力)。
（4)、 反應平衡
有機介質能改變某些酶催化的反應平衡。
例如：水解酶類（蛋白水解酶)
在水介質中，水的濃度為55.5mol/L，平衡趨向水解方向，
如在含水量極低的有機介質中，平衡向含成方向偏移。
實例：（酶) 合成)產物 溶劑 合成收率
枯草桿菌蛋白酶 核糖核酸酶 甘油90% 50%
無色桿菌蛋白酶 胰島素 乙醇30% 80%
凝血酶 人生長素 甘油80% 20%
（5)、 分子印跡和pH記憶
酶在凍干前可用配體作印跡。
競爭性抑制劑，可誘導酶活性中心構象發(fā)生變化，形成一種高活性構象，而此種構象在除去抑制劑后，因酶在有機介質中的高度剛性而得到保持。
pH記憶：
酶在有機介質中能“記住”它最后存在過的水溶液的pH值，因該pH值決定了酶分子上有關基團的解離狀態(tài)，這種狀態(tài)在凍干過程和分散到有機介質中之后仍得到保持。
第四節(jié) 酶的作用機理
一、 專一性的機理
（一) 酶專一性類型
一般說來，一種分子能成為某種酶的底物，必須具備兩個條件：
分子上有被酶作用的化學鍵。
分子上有一個或多個結合基團能與酶活性中心結合。
2、 誘導楔合模型
酶分子與底物分子接近時，酶蛋白質受底物分子誘導，構象發(fā)生有利于與底物結合的變化，酶與底物在此基礎上互補楔合，進行反應。
P271 圖4—18
二、 高效性的機理
1、 鄰近效應與定向效應
酶把底物分子（一種或兩種)從溶液中富集出來，使它們固定在活性中心附近，反應基團相互鄰近，同時使反應基團的分子軌道以正確方位相互交疊，反應易于發(fā)生。
兩種效應對反應速度的影響
①使底物濃度在活性中心附近很高
甚至比溶液中高10萬倍，提高反應速度。
②酶對底物分子的電子軌道具有導向作用
舉例：酚羥基和羧基環(huán)化成內酸
圖
3個CH3固定了-OH和-COOH的相對方位。
③酶使分子間反應轉變成分子內反應
反應速度提高：107
圖
④鄰近效應和定向效應對底物起固定作用
酶底復合物壽命比一般雙分子相互碰撞的平均壽命長，前者10-7-10-4秒，后者10-13秒，增大了產物形成的機率。
2、 扭曲變形和構象變化的催化效應
酶中某些基團可使底物分子的敏感鍵中某些基團的電子云密度變化，產生電子張力。
P276 圖4-20
環(huán)狀反應物I水解開環(huán)，環(huán)扭曲能量大量釋放，加速反應。
底物與酶蛋白接觸，加速反應。
①酶從低活性形式轉變?yōu)楦呋钚孕问?BR>②底物扭曲、變形
③底物構象變化，變得更像過度態(tài)結構，大大降低活化能。
3、 共價催化
酶作為親核基團或親電基團，與底物形成一個反應活性很高的共價中間物，此中間物易變成過渡態(tài)，反應活化能大大降低，提高反應速度。
①親核共價催化
絲氨酸羥基、Cys的-SH、His的咪唑基。
舉例：咪唑基催化對硝基苯乙酸酯水解。
圖
②親電共價催化
親電基團攻擊底物的富電子基團
例：Asp轉氨酶催化Asp 轉氨反應
圖
P278 表4-13 形成共價ES復合物的某些酶
4、 酸堿催化
酶分子的一些功能基團起質子供體或質子受體的作用。
參與酸堿催化的基團：氨基、羧基、巰基、酚羥基、咪唑基。
P279 表4-14 酶分子中可作為廣義酸堿的功能基團
影響酸堿催化反應速度的兩個因素
⑴酸堿強度，咪唑基在pH6附近給出質子和結合質子能力相同，是最活潑的催化基團。
⑵給出質子或結合質子的速度，咪唑基最快
①酸催化酯、酰胺和肽的水解
圖
過程：共軛酸與＞C=0氧形成氫鍵，使＞C=0碳帶更多正電荷，更易吸引H2O分子上的氧，降低＞C=0碳與H2O氧形成共價鍵的活化能；接著，共軛酸將H+轉移給＞C=0氧，自己成為共軛堿，并從H2O分子吸引一個H+， 回復原狀。
②堿催化酯、酰胺水解
圖
過程：共軛堿先與H2O中H形成氫鍵，使H2O中氧的電負性增強，更易對＞C=0碳進行親核進攻，降低碳氧鍵生成的活化能。
5、 活性中心的微環(huán)境
⑴ 疏水環(huán)境
酶活性中心附近往往是疏水的，介電常數(shù)低，可加強極性基團間的反應。
⑵電荷環(huán)境
在酶活性中心附近，往往有一電荷離子，可穩(wěn)定過渡態(tài)的離子，增加酶促反應速度。如溶菌酶Asp52帶負電荷，可以穩(wěn)定過渡態(tài)的正離子。
酶催化反應的高效性，可能是由于以上五種因素中的幾種因素協(xié)同作用的結果，而非酶催化反應往往只有一種催化機制。
三、 某些酶的活性中心及其作用機理
（一) 酶的活性中心
1、 活性中心的概念
對于不需要輔酶的酶來說，活性中心就是酶分子在三維結構上比較靠近的少數(shù)幾個氨基酸殘基或是這些殘基的某些基團，它們在一級結構上相距可能很遠，通過肽鏈的盤繞、折疊而在空間構象上相互靠近。
對于需要輔酶的酶來說，輔酶分子或輔酶分子的某一部分結構往往就是活性中心的組成部分。
一般認為，活性中心有兩個功能部位：底物結合部位，催化部位
活性中心外的部位為活性中心的形成提供了結構基礎 。
2、 活性中心的氨基酸殘基
有七種a.a在酶活性中心出現(xiàn)的頻率最高，它們是Ser、His、Cys、Tyr、Asp、Glu、Lys。
活性中心的a.a殘基往往分散在相互較遠的a.a順序中，有的甚至分散在不同的肽鏈上，如α-胰凝乳蛋白酶活性中心的幾個a.a殘基，分別位于B、C兩個肽鏈上，靠分子空間結構的形成，集中在酶分子特定區(qū)域，成為具有催化功能的活性中心。
酶分子a.a殘基分類
（1)接觸殘基
它們與底物接觸，參與底物的化學轉變，此類a.a殘基的一個或幾個原子與底物分子中一個或幾個原子的距離都在一個鍵距離之內（1.5-2A)。
它們的側鏈起與底物結合作用的稱為結合基團，起催化作用的稱為催化基團。
（2)輔助殘基
它不與底物接觸，而是在使酶與底物結合及協(xié)助接觸殘基發(fā)揮作用方面起作用。
上述兩類殘基構成酶活性中心。
（3)結構殘基
在維持酶分子正常三維構象方面起重要作用，它們與酶活性相關，但不在酶活性中心范圍內，屬于酶活性中心以外的必需殘基
上述三類殘基統(tǒng)稱酶的必需基團，若被其它a.a取代，往往造成酶失活。
（4)非貢獻殘基（非必需基團)
它們對酶活性的顯示不起作用，可由其它a.a代替，且在酶分子中占很大比例。
它們可能在免疫，酶活性調節(jié)，運輸轉移，防止降解等方面起作用。
結合底物作用（結合殘基)
接觸殘基
活性中心 催化作用（催化基團)
必需基團 輔助殘基
活性中心外（結構殘基)
酶蛋白
非必需基團
3、 活性中心區(qū)域的一級結構
由于一些酶的活性中心一級結構結構與催化機理極其相似，可把它們歸為一族。
蛋白水解酶就有幾個族：
（1)絲氨酸蛋白酶（胰凝乳蛋白酶、胰乳蛋白酶、彈性蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶等)
（2)鋅蛋白酶（羧肽酶等)
（3)巰基蛋白酶（木瓜蛋白酶等)
（4)羧基蛋白酶（胃蛋白酶等)
在同一族酶中，活性中心一級結構的a.a順序極相似。
酶 a.a順序
胰蛋白酶（牛) Asp-Ser-Cys-Gln-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Val-Val-Cys-Ser-Gly-Lys
胰凝乳蛋白酶（牛) Ser-Ser-Cys-Met-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-Val-Cys-Lys- Lys-Asn
彈性蛋白酶（豬) Ser-Gly-Cys-Gln-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-His-Cys-Leu-Val-Asn
凝血酶（牛) …Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser-Pro
這4個源于哺乳動物的酶活性中心，都含有一個包括Ser在內的完全相同的六肽：
…Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro…
u 同源的趨異進化
來自胰臟的胰凝乳蛋白酶（Phe、 Tyr、 Trp、)、胰蛋白酶（Lys、Arg )和彈性蛋白酶（疏水殘基)，活性中心Ser附近的a.a順序相同，且分子一級結構中有40%a.a順序相同，三維結構也相同，表明它們起源于共同的祖先，但是它們的底物專一性不同。
這種來源于共同祖先，經基因突變而得出不同專一性的結果稱為同源的趨異進化。
u 異源的趨同進化
來自枯草桿菌的Ser蛋白酶的結構與上述三種酶很不同，且活性中心Ser附近的a.a順序也不同（-Gly-Thr-Ser-Met-Ala-Ser)。
電荷中繼網的位置也不同：
電荷中繼網的位置也不同：
Asp102-His57-Ser195（胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶)
Asp32-His64-Ser221（枯草桿菌蛋白酶)
這表明枯草桿菌蛋白酶與胰凝乳蛋白酶等三個酶來源不同，但它們的電荷中繼網相同，功能相同，這種情況稱異源的趨同進化。
4、 判斷和研究活性中心的主要方法
（1)通過酶的專一性（2)酶的化學修飾法（3)親合標記法（4)X射線晶體衍射法
（二) 酶作用機理舉例
1、 胰凝乳蛋白酶的作用機理：
（1)、 專一性
圖
該酶需要底物有一個疏水基團結合于酶上的疏水部位，這個結合起定位作用，使底物敏感鍵對準酶的催化基團。
疏水定位基團：Phe、Tyr、Trp
（2)、 催化機理
① 活性中心：Ser195—His57—Asp102，三者構成一個氫鍵體系，His57的咪唑基是Ser195的羥基和Asp102的羧基之間的橋梁，這個氫鍵體系稱為電荷中繼網（harge relay network)。通過電荷中繼網，進行酸堿催化及共價催化。Ser195由于His57和Asp102的影響而成為很強的親核基團，它是活性中心的底物結合部位，His57是活性中心的催化部位。
ＰP285 圖4-27，P287 圖4-30 胰凝乳蛋白酶中的電荷中繼網
② 胰凝乳蛋白酶對多肽的水解過程
P288 圖4—31胰凝乳蛋白酶對多肽的水解過程
第一階段 �；�
Ser195--OH 中的氧攻擊肽鍵的羰基碳，形成四聯(lián)體過渡態(tài)（Ser195—OH、底物的酰基、底物的氨基、His的咪唑)，敏感肽鍵斷裂，底物中的胺成分通過氫鍵與酶的His57咪唑基相連，底物的羧基部分酯化到Ser195的羥基上。
第二階段 脫酰
電荷中繼網從水中吸收一個質子，結果產生的OH-攻擊連在Ser195上底物的羧基碳原子，形成四聯(lián)體過渡態(tài)，然后His57供出一個質子給Ser195上的氧原子，結果底物中的酸成分從Ser195上釋放。
除胰凝乳蛋白酶外，在催化中具有Asp-His-Ser電荷中繼網的還有胰蛋白酶，彈性蛋白酶，枯草桿菌蛋白酶等，但它們的底物結合部位不同，底物專一性也不同。
P288 圖4-32三種胰臟中的蛋白酶的底物結合部胰凝乳蛋白酶 胰蛋白酶 彈性蛋白酶
可供芳香環(huán)及大 可供帶電荷的 只能讓Ala等小分子
的非極性側鏈伸入 Lys.、Arg進入 進入
第五節(jié) 多酶體系與酶活性的調節(jié)控制
一、 多酶體系
（一) 多酶體系及其分類
細胞中的許多酶，常常在一個連續(xù)的反應鏈中起作用，前一個反應的產物是后一個反應的底物。
多酶體系：multienzyme system在完整細胞內的某一代謝途徑中，由幾個酶形成的反應鏈體系。
可分為三種類型：可溶性的（分散性的)，結構化的（多酶復合體)，在細胞結構上有定位關系的（結構化程度更高)。
P297 圖4—42（分散性的多酶體系) 圖4-43 （多酶復合體)
（二) 多酶體系的自我調節(jié)
（1)大部分具有自我調節(jié)能力的多酶體系，第一步反應就是限速步驟，它控制著全部反應序列的總速度。
（2)反饋抑制與底物激活
催化第一步反應的酶，大多都是別構酶，能被全部反應序列的最終產物所抑制，有時則是反應序列分叉處的酶受到最終產物的抑制，稱為反饋抑制；有的被底物激活
P299 圖4-45反饋抑制與底物激活
正調節(jié)物：一般是別構酶的底物，可以激活別構酶。
負調節(jié)物：可以抑制別構酶，一般是代謝序列的最終產物。
通過多酶體系的自我調節(jié)（反饋抑制和底物激活)，可使代謝過程得以協(xié)調地、有條不紊地合理進行。
下面討論具體到每個酶是怎樣調節(jié)的
二、 酶活性的調節(jié)控制和調節(jié)酶
調節(jié)酶：活性可被調節(jié)的酶，主要是別構酶和共價調節(jié)酶。
（一) 別構效應的調控
別構效應：調節(jié)物（效應物)與別構酶分子中的別構中心（調節(jié)中心)結合后，誘導產生或穩(wěn)定住酶分子的某種構象，使酶活性中心對底物的結合催化作用受到影響，從而調節(jié)酶促反應的速度。
（1)、 別構酶的結構特點和性質
（1) 已知的別構酶都是寡聚酶，含有兩個或兩個以上亞基
（2) 具有活性中心和別構中心（調節(jié)中心)，活性中心負責底物結合和催化，別構中心負責調節(jié)酶反應速度�；钚灾行暮蛣e構中心處在不同的亞基上或同一亞基的不同部位上。
（3) 多數(shù)別構酶不止一個活性中心，活性中心間有同種效應，底物就是調節(jié)物：有的別構酶不止一個別構中心，可以接受不同的代謝物的調節(jié)。
（4) 別構酶由于同位效應和別構效應，不遵循米式方程，動力學曲線也不是典型的雙曲線型，而是S型（同位效應為正協(xié)同效應)和壓低的近雙曲線（同位效應為負協(xié)同效應)。
（2)、 別構酶的動力學曲線
① 同位效應為正協(xié)同效應的別構酶是S型曲線
P303 圖4-46 4-47
這種S形曲線體現(xiàn)為，當?shù)孜餄舛劝l(fā)生較小變化時，別構酶可以極大程度地控制反應速度，這是別構酶可以靈活地調節(jié)反應速度的原因。
米氏酶：[S]0.9/[S]0.1=81
別構酶：[S]0.9/[S]0.1=3
表明當?shù)孜餄舛劝l(fā)生較小變化時，如上升3倍，別構酶的酶促反應速度可以從0.1Vmax升至0.9Vmax 。
當增加正調節(jié)物濃度時Km減小，親和力增大，協(xié)同性減�。寒斣黾迂撜{節(jié)物的濃度時Km增加，親和力減小，協(xié)同性增大（對底物濃度的反應靈敏度增加)。
② 同位效應為負協(xié)同效應的別構酶是近似雙曲線
P304圖4-48
負協(xié)同效應時酶的反應速度對底物濃度的變化不敏感
（3)、 別構酶調節(jié)活性的機理
① 序變模型：
酶分子中亞基結合底物后，構象逐個地依次變化。
② 齊變模型：
（4)、 別構酶的鑒定
① S型曲線是必要但不充分條件
② 脫敏作用
③ [S]0.9／[S]0.1
Rs=81 米氏酶
Rs＜81 正協(xié)同
Rs＞81 負協(xié)同
④ Hill系數(shù)法
（二) 可逆共價修飾的調控（共價調節(jié)酶)
共價調節(jié)酶：酶分子被其它的酶催化進行共價修飾，從而在活性形式與非活性形式之間相互轉變。
舉例：糖原磷酸化酶
P313 圖4-57
信號的級聯(lián)放大：
1分子磷酸化酶激酶，活化生成幾千個磷酶化酶a
1分子磷酸化酶a，催化生成幾千個1-P-G
共價調節(jié)酶的兩種常見類型
①磷酸化 去磷酸化 -OH ATP
②腺苷�；� 脫腺苷�；� 腺苷�；葾TP提供
（三) 酶原的激活
具有不可逆性。屬于此類的有消化系統(tǒng)中的酶（胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胃蛋白酶)和血液凝固系統(tǒng)中的酶。
（1)、 胰凝乳蛋白酶原的激活（由胰蛋白酶激活)
P314 圖4-58
（2)、 胰蛋白酶對胰臟蛋白酶原的激活
腸激酶
胰蛋白酶原 胰蛋白酶
胰凝乳蛋白酶原 彈性蛋白酶原
胰蛋白酶
胰凝乳蛋白酶 彈性蛋白酶
羧肽酶原 羧肽酶
（四) 專一性調控蛋白（調控因子)對酶活性的調節(jié)控制
鈣調蛋白、激素結合蛋白，促進或抑制特異的酶活性
第六節(jié) 酶與抗體——抗體酶 abzyme(antibody enzyme)
參閱 P293
又稱催化性抗體（catalytic antibody)，是一種具有催化功能的抗體分子。
過渡態(tài)理論：酶與底物不是在基態(tài)，而是在過渡態(tài)結構互補，親和力最強，釋放出的結合能使過渡態(tài)結合物能級降低，利于反應物分子越過能壘，加速反應。
而抗體與抗原是基態(tài)結合。
第七節(jié) 同工酶、誘導酶
1、 同工酶
能催化同一種化學反應，但其酶蛋白本身的分子結構不同的一組酶，存在于生物的同一種屬或同一個體的不同組織中，甚至同一組織、同一細胞中。
哺乳動物乳酸脫氫酶有5種
CH3CHOH-COO-+NAD+ LDH CH3COCOO-+NADH+H+
均由4個亞基組成
HHHH 在心肌中占優(yōu)勢
HHHM
HHMM
HMMM
MMMM 在骨骼肌中占優(yōu)勢
2、 誘導酶
酶可相對地區(qū)分為結構酶和誘導酶。
結構酶：指正常細胞內存在的酶，它的含量較穩(wěn)定，受外界因素影響很小。
誘導酶：在正常細胞中含量極少或沒有，當細胞中加入特定誘導物后，誘導產生的酶，含量在誘導物存在下顯著增高，誘導物往往是該酶的底物或底物類似物。
如：大腸桿菌中的β-半乳糖苷酶
E.coli在含Glc的培養(yǎng)基中
E.coli在只含乳糖的培養(yǎng)基中：Glc-β(1→4)Gal苷
第八節(jié) 酶工程
計劃：8學時
